Septinas constituem uma família de proteínas de ligação a GTP que foram inicialmente identificadas em levedura Saccharomyces cerevisiae, mas também estão presentes em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de leveduras, Drosophila e cérebros de mamíferos na forma de filamentos, porém o mecanismo através do qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido. Septinas são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. O gene SEPT4 foi identificado por M. Tanaka e colaboradores a partir do cDNA de cérebro humano e apresentou duas distintas transcrições: Bradeiona ? e ?. Interessantemente, além de cérebro e coração, as proteínas Bradeiona Α e Β. são detectadas somente em câncer do cólon, reto, próstata e melanoma maligno. Neste trabalho, o gene da proteína Bradeiona Β foi subclonado em um vetor de expressão bacteriano, produzido em E. coli e purificado com sucesso. O espectro de dicroísmo circular (CD) mostrou o perfil característico de proteínas com hélices a na estrutura secundária. Resultados de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicam que a septina Bradeina foi produzida na forma de um estável oligômero com características monodispersivas, que foi subseqüentemente cristalizado em PEG6000. A atividade GTPase da Bradeiona Β foi comprovada através da técnica de eletroforese capilar (CE), mostrando-se absolutamente dependente de íons Mg2+. Inibição da atividade GTPase foi verificada em altas concentrações de Mg2+ (maiores que 5 mM). Com a finalidade de caracterizar os domínios preditos da Bradeiona Β (Fragmento Conservado e domínio GTPase), essas regiões foram previamente definidas, expressas em E. cozi e purificadas com sucesso. Resultados de CD, SEC, espectroscopia de fluorescência e NMR-600MHz indicam que o FC foi produzido na forma de um estável monômero com pouca estrutura secundária regular. Resultados de DLS e CD indicam que a fusão 6xHis-DGTPase foi produzida na forma de um oligômero com a presença de hélices a na estrutura secundária. A fusão 6xHis-DGTPase mostrou-se instável a altas concentrações na ausência de imidazol. A atividade GTPase da fusão GST+DGTPase foi comprovada, similarmente a Bradeiona , através da técnica de CE. Novamente, verificou-se dependência de íons Mg2+ (para a atividade catalítica) e inibição em altas concentrações de Mg2+. A fusão GST+DGTPase também foi capaz de hidrolisar ATP. Espera-se que as informações relatadas neste estudo proporcionem um alicerce para estudos estruturais/funcionais futuros das proteínas Bradeiona Α e Βoutras septinas. / Septins form a class of eukaryoyic guanine nucleotide-binding proteins that were first identified in budding yeast. Septins purified from yeast, Drosophila and mammalian brain form filaments, however the mechanism by which the filaments assemble is unclear. Septins have a highly conserved structure, which includes a central GTP-binding domain, a variable N-terminal region, and most septins also contain a coiled coil domain at the Cterminus. Bradeion p is one of the splice variants of the human septin gene, SEPT4, recently isolated by expression screening of an adult human brain cDNA library. The Bradeion gene resides at 17q23, and has been shown to present specific expression in both human colorectal cancer, urologic cancers and malignant melanoma. In order to characterize the GTPase activity of Bradeion Β , the protein was successfully expressed in E. coli and purified. The recombinant protein was characterized by circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and a novel non-radioactive enzyme assay, which utilizes capillary electrophoresis (EC) to monitor GTP hydrolysis. The CD spectrum exhibited the typical shape characteristic of the presence of helical elements of secondary structure and the DLS pattern was indicative of a monodisperse solution, which was readily crystallized in the presence of PEG6000. GTP hydrolysis was shown to be Mg2+ dependent within the low millimolar range but at 5 mM was inhibitory. In order to characterize the predicted domains of Bradeion Β, these defined regions were successfully expressed in E. cozi and purified. The CD spectrum of CF exhibited the shape typically found for non-regular structure. The results of fluorescence spectroscopy, gel filtration (SEC) and NMR-600MHz also corroborate with the CD results indicating an irregular structure. The fusion protein 6xHis-DGTPase exhibited a CD spectrum with the typical shape characteristic of the presence of helical elements but was show to be instable at high concentrations in the absence of imidazole. To characterize the GTPase activity of the fusion protein GST+DGTPase, the CE technique was used to monitor GTP hydrolysis. Analysis by CE showed that GST+DGTPase was functional, since both GTP and ATP hydrolysis was observed in a Mg2+ dependent manner. This work provides novel approaches, which should aid in the fbture study of the structure and fùnction of Bradeion Α e Β, others septins and related GTPases.

Septinas constituem uma família de proteínas de ligação a GTP que foram inicialmente identificadas em levedura Saccharomyces cerevisiae, mas também estão presentes em outros eucariotos com exceção de plantas. Septinas são purificadas de leveduras, Drosophila e cérebros de mamíferos na forma de filamentos, porém o mecanismo através do qual acorre a formação destes filamentos ainda não é muito bem compreendido. Septinas são constituídas de três regiões principais: um N-terminal variável, um domínio central GTPase altamente conservado e um domínio coiled-coil C-terminal. O gene SEPT4 foi identificado por M. Tanaka e colaboradores a partir do cDNA de cérebro humano e apresentou duas distintas transcrições: Bradeiona ? e ?. Interessantemente, além de cérebro e coração, as proteínas Bradeiona Α e Β. são detectadas somente em câncer do cólon, reto, próstata e melanoma maligno. Neste trabalho, o gene da proteína Bradeiona Β foi subclonado em um vetor de expressão bacteriano, produzido em E. coli e purificado com sucesso. O espectro de dicroísmo circular (CD) mostrou o perfil característico de proteínas com hélices a na estrutura secundária. Resultados de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e espalhamento dinâmico de luz (DLS) indicam que a septina Bradeina foi produzida na forma de um estável oligômero com características monodispersivas, que foi subseqüentemente cristalizado em PEG6000. A atividade GTPase da Bradeiona Β foi comprovada através da técnica de eletroforese capilar (CE), mostrando-se absolutamente dependente de íons Mg2+. Inibição da atividade GTPase foi verificada em altas concentrações de Mg2+ (maiores que 5 mM). Com a finalidade de caracterizar os domínios preditos da Bradeiona Β (Fragmento Conservado e domínio GTPase), essas regiões foram previamente definidas, expressas em E. cozi e purificadas com sucesso. Resultados de CD, SEC, espectroscopia de fluorescência e NMR-600MHz indicam que o FC foi produzido na forma de um estável monômero com pouca estrutura secundária regular. Resultados de DLS e CD indicam que a fusão 6xHis-DGTPase foi produzida na forma de um oligômero com a presença de hélices a na estrutura secundária. A fusão 6xHis-DGTPase mostrou-se instável a altas concentrações na ausência de imidazol. A atividade GTPase da fusão GST+DGTPase foi comprovada, similarmente a Bradeiona , através da técnica de CE. Novamente, verificou-se dependência de íons Mg2+ (para a atividade catalítica) e inibição em altas concentrações de Mg2+. A fusão GST+DGTPase também foi capaz de hidrolisar ATP. Espera-se que as informações relatadas neste estudo proporcionem um alicerce para estudos estruturais/funcionais futuros das proteínas Bradeiona Α e Βoutras septinas. / Septins form a class of eukaryoyic guanine nucleotide-binding proteins that were first identified in budding yeast. Septins purified from yeast, Drosophila and mammalian brain form filaments, however the mechanism by which the filaments assemble is unclear. Septins have a highly conserved structure, which includes a central GTP-binding domain, a variable N-terminal region, and most septins also contain a coiled coil domain at the Cterminus. Bradeion p is one of the splice variants of the human septin gene, SEPT4, recently isolated by expression screening of an adult human brain cDNA library. The Bradeion gene resides at 17q23, and has been shown to present specific expression in both human colorectal cancer, urologic cancers and malignant melanoma. In order to characterize the GTPase activity of Bradeion Β , the protein was successfully expressed in E. coli and purified. The recombinant protein was characterized by circular dichroism (CD), dynamic light scattering (DLS) and a novel non-radioactive enzyme assay, which utilizes capillary electrophoresis (EC) to monitor GTP hydrolysis. The CD spectrum exhibited the typical shape characteristic of the presence of helical elements of secondary structure and the DLS pattern was indicative of a monodisperse solution, which was readily crystallized in the presence of PEG6000. GTP hydrolysis was shown to be Mg2+ dependent within the low millimolar range but at 5 mM was inhibitory. In order to characterize the predicted domains of Bradeion Β, these defined regions were successfully expressed in E. cozi and purified. The CD spectrum of CF exhibited the shape typically found for non-regular structure. The results of fluorescence spectroscopy, gel filtration (SEC) and NMR-600MHz also corroborate with the CD results indicating an irregular structure. The fusion protein 6xHis-DGTPase exhibited a CD spectrum with the typical shape characteristic of the presence of helical elements but was show to be instable at high concentrations in the absence of imidazole. To characterize the GTPase activity of the fusion protein GST+DGTPase, the CE technique was used to monitor GTP hydrolysis. Analysis by CE showed that GST+DGTPase was functional, since both GTP and ATP hydrolysis was observed in a Mg2+ dependent manner. This work provides novel approaches, which should aid in the fbture study of the structure and fùnction of Bradeion Α e Β, others septins and related GTPases.

Colorectal cancer (CRC) is the third most widespread and fourth most fatal malignancy disease. The CRC from a primary site can spread to other tissues, forming secondary tumours. CRC can metastasise to the liver through the effect of K-Ras and Pten mutation (Mt.) (Abbas et al. 2020). This study aimed to assess the hypothesis that the Ran inhibitor mebendazole MBZ reduces cell invasion and metastasis of CRC. I have investigated MBZ effect on the CRC isogenic human cell lines with specific mutations (HCT-116 K-Ras, DLD-1 K-Ras and Pten deletion and wild type HCT-116 and DKO-3. I used qRT-PCR and western blotting to identify expression levels of various genes and signalling molecules after treatment with 0.5 mM MBZ. In addition, several assays were performed to investigate MBZ effect on biological properties of the cells such as proliferation, migration, invasion, and colony formation. MBZ downregulated Ran and induced apoptosis through inhibition of Bcl-2 expression as well as inducing caspase -3, -7, -9 and PARP cleavage. Moreover, MBZ showed an effect on immune response by down regulating C5a, IL-1ß and IL-1α analysed at mRNA level. When treated with MBZ, the migration, invasion and colony formation abilities of HCT-116 K-Ras Mt., DLD-1 K-Ras Mt. and HCT-116 Pten-/- were significantly reduced compared to a control treated cell line. This was also the case with wild type cell lines such as HCT-116 and DKO-3. Furthermore, signalling molecules such as p- Erk 1/2 and p- Akt were upregulated after MBZ treatment and exert inhibition on Akt 1/2/3 and VEGFR1/2 mRNA levels. In conclusion; MBZ which is a Ran inhibitor, has significantly reduced proliferation, colony formation, and migration in colorectal cell lines with K-Ras and Pten gene deletion compared to wild type cells in a dose-dependent manner. This work paves the way to clinical validation of MBZ as a combination therapy for reducing the invasion of CRC cells.