Le contrôle du paludisme ne semble aujourd'hui envisageable que par stratégies combinées ciblant différents stades du parasite. Chez le vecteur, certains mécanismes de la réponse immunitaire pourraient être manipulés pour bloquer le développement sporogonique du parasite. Cette thèse examine les effets de la diversité du vecteur et du parasite dans le couple le plus important en termes d'épidémiologie, A. gambiae - P. falciparum. Des polymorphismes de gènes de l'immunité du moustique contrôlant le niveau d'infection ont été identifiés par étude d'association. Certains d'entre eux ont un effet spécifique selon les isolats de parasites, suggérant de potentielles interactions génotype X génotype. Nous avons déterminé un déséquilibre de liaison très bas dans les populations naturelles de vecteurs, validant notre approche par gènes candidats. Les caractéristiques et les forces évolutives faisant d'A. gambiae un vecteur du paludisme majeur sont discutées. Les diverses populations de vecteurs et parasites peuvent interagir de manière spécifique. Pour tester cela, des infections par des isolats de parasites sympatriques et allopatriques ont été comparées, montrant des intensités plus faibles dans les couples sympatriques. Les profils d'expression des gènes montrent cependant peu de régulations spécifiques aux populations, mais plutôt des différences extrêmes selon les isolats de parasites. Ces résultats suggèrent des effets importants de la diversité entre populations et individus. En conclusion, cette thèse souligne l'importance de la prise en compte de la diversité naturelle des vecteurs et parasites dans les recherches futures sur leurs interactions. / To achieve malaria control a variety of approaches must be combined targeting different stages of the parasites life cycle. With better understanding of mosquito immunity, it is hoped that aspects of natural resistance can be manipulated to prevent parasite development. This thesis investigates the effect of both mosquito and parasite diversity on the mosquitoes response to malaria using the most important human malaria system; Anopheles gambiae-Plasmodium falciparum in natural/semi-natural conditions. Mosquito loci are identified that significantly control infection phenotype, some of which act in a parasite isolate specific manner, highlighting their potential involvement in genotype by genotype interactions. Such research is moving towards genomewide studies; however, on finding very low linkage disequilibrium in wild mosquitoes, it favors candidate gene association studies. A. gambiae characteristics that make it such a good malaria vector are discussed and the evolutionary forces driving these traits. Selection behind vector-parasite interactions can differ spatially and temporally causing specificities in sympatric couples. Sympatric and allopatric mosquito infections with malaria are compared, showing that sympatric infections develop lower infection intensities suggesting local adaptation. Mosquito gene expression profiles highlight a small number of genes differentially regulated between sympatric and allopatric infections, however extreme differences in gene regulation are observed within populations, probably driven by the variable nature of malaria parasites. This thesis highlights the importance of taking into account natural diversity in future research.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.

O Antígeno 1 de Membrana Apical (AMA-1) de Plasmodium sp tem sido sugerido como candidato a compor uma vacina contra a malária. No presente estudo geramos cinco proteínas recombinantes baseadas em diferentes regiões do ectodomínio de AMA-1 de Plasmodium vivax, o qual compreende os domínios I a III, com intuito de mapear regiões particularmente imunogênicas da proteína. Cada uma das cinco proteínas recombinantes foi expressa em Eschericha coli a partir do vetor pET-28a em fusão com a cauda de histidina e purificadas por cromatografia de afinidade. As diferentes proteínas recombinantes foram comparadas, por ELISA, quanto ao reconhecimento por anticorpos IgM, IgG e subclasses de IgG de 100 indivíduos infectados por P. vivax procedentes de áreas endêmicas do Estado do Pará e 32 indivíduos não infectados que relataram terem sido acometidos de mais de 10 episódios prévios de malária procedentes do município de Terra Nova do Norte (MT). As freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgM foram mais baixas e variaram de 4% (DIII) a 36% (DII-III). Por outro lado, as freqüências de indivíduos que apresentaram anticorpos IgG para DI, DII, DIII, DI-II e DII-III foram 13%, 65%, 12%, 59% e 58%, respectivamente. Podemos observar que as proteínas recombinantes contendo o DII foram particularmente imunogênicas durante a infecção natural. Com o objetivo de avaliar se os epítopos reconhecidos nas cinco proteínas baseadas nos diferentes domínios estão expostos na proteína recombinante correspondente ao ectodomínio (DI-III) gerada previamente, realizamos ensaios de inibição por ELISA utilizando placas sensibilizadas com a proteína DI-III. Nossos resultados sugerem a presença de um maior número de epítopos comuns entre as proteínas recombinantes baseadas nos domínios I-II e ectodomínio de AMA-1. Além disso, observamos que a proporção de indivíduos que apresentaram anticorpos contra DII, DI-II e DII-III aumentou de acordo com o maior número de exposições prévias ao P. vivax. As subclasses de IgG que predominaram contra todas as proteínas foram IgG1, IgG3 e IgG4. Em conjunto, nossos resultados sugerem que as proteínas recombinantes contendo o DII podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra malária vivax em primatas não-humanos. / The Apical Membrane Antigen 1 (AMA-1) of Plasmodium sp has been suggested as a vaccine candidate against malaria. Herein, to identify novel antigenic epitopes on the Plasmodium vivax AMA-1 ectodomain, we have generated five recombinant proteins, comprising domains I to III. All recombinant proteins were expressed in Escherichia coli using the pET-28a vector system fused to hexahistidine tag for purification by affinity chromatography. Recognition of recombinant proteins by antibodies was evaluated using a panel of sera collected from onehundred P. vivax -infected patients resident in the State of Pará and from thirty-two non-infected individuals, living in the State of Mato Grosso and who have faced a minimum of ten malaria episodes. ELISA analyses demonstrated that protein recognition was highly dependent on IgG antibodies, raging from 13%, 65%, 12%, 59% up to 58%, respectively for DI, DII, DIII, DI-II and DII-III domains. Indeed, we have noticed a lower frequency of recognition, ranging from 4% (DIII) to 36% (DII-III), by sera from those individuals that presented IgM antibodies. Collectively, these data suggest that the DII domain is particularly immunogenic during natural infections. Next, to verify whether the epitopes recognized in these five different recombinant proteins were also expressed in a recombinant protein spanning domains I through III (DI-III), we carried out ELISA inhibition assays using plates coated with the DI-III recombinant protein. Our findings revealed the presence of a higher number of common epitopes among recombinant proteins based on domains I-II and the AMA-1 ectodomain. Moreover, we observed that the proportion of individuals who had presented antibodies against DII, DI-II and DII-III domains increased according to the previous number of P. vivax episodes. Overall, IgG1, IgG3 and IgG4 antibodies were prevalent to all proteins. Taken together, our results demonstrated that DII domain is highly recognized, mainly by IgG antibodies; and open promising perspectives to use this region as an experimental vaccine in non-human primates capable to induce protective immunity against vivax malaria.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.

Diversas proteínas de superfície de merozoítas (MSPs) de Plasmodium têm sido consideradas candidatas a compor uma vacina contra a malária. Nos últimos anos estudamos diversos aspectos da resposta imune naturalmente adquirida contra proteínas recombinantes baseadas nas MSPs de P. vivax. Estes estudos demonstraram que estas proteínas recombinantes mantêm suas funções imunológicas, podendo servir como base para a caracterização de suas estruturas tridimensionais. Com o objetivo de obter informações estruturais sobre as MSPs de P. vivax, 10 proteínas recombinantes, correspondentes à região C-terminal da MSP-1 (MSP119), e diferentes regiões da MSP-3α e MSP-3β foram expressas em Escherichia coli. Os dados estruturais da MSP119 foram obtidos por modelagem molecular com base nas coordenadas cristalográficas da MSP19 de P. cynomolgi. Por outro lado, existem poucas informações estruturais sobre as proteínas da família MSP-3 de Plasmodium. A análise da estrutura primária dessas proteínas indica que elas apresentam um domínio central rico em alaninas que estão organizadas como motivos \"heptads\". Esse tipo de estrutura primária favorece a formação de estruturas do tipo α-hélices e \"coiled-coil\" (CC). No presente estudo, a composição da estrutura secundária de cada proteína recombinante foi caracterizada preliminarmente por ensaio de Dicroísmo Circular, realizado na região do UV distante. Com base nos resultados obtidos, selecionamos duas proteínas recombinantes baseadas na região C-terminal da MSP-3α (CC4 e CC5) para análises biofísicas mais detalhadas. Inicialmente, demonstramos por espectrometria de massa que ambas as proteínas têm massa molecular esperada. Entretanto, os dados obtidos por cromatografia em gel filtração sugeriram que essas proteínas formam oligômeros. No caso específico da proteína CC5, estes dados foram confirmados por ultracentrifugação analítica que indicou a formação de tetrâmeros elongados, corroborando com a formação de estrutura do tipo \"coiled-coil\". Como o papel biológico dessas proteínas não é conhecido, os dados estruturais obtidos neste estudo podem servir como base para o entendimento da função dessas proteínas. Na segunda parte deste projeto, selecionamos cinco proteínas recombinantes para estudos comparativos de reconhecimento por anticorpos IgG de indivíduos procedentes de áreas endêmicas de malária vivax. Tais estudos confirmaram dados prévios que as MSPs são imunogênicas em infecções naturais. Em conjunto, nossos resultados sugerem que, assim como a MSP119, proteínas recombinantes baseadas na MSP-3a e MSP-313 podem ser exploradas em futuros estudos de indução de imunidade protetora contra a malária vivax em primatas não humanos. / Several merozoite surface proteins (MSPs) of Plasmodium have been considered candidates to compose a vaccine against malaria. In the last years, we have studied severaI aspects of the natural/y acquired immune response against recombinant proteins based on MSPs of P. vivax. These studies demonstrated that the recombinant proteins maintain their immunological functions and could be used for the characterization of their three-dimensional structure. To gain structural information on the MSPs of P. vivax, 10 recombinant proteins corresponding to the C-terminal region of MSP-1 (MSP119) and to different regions of the MSP-3α and MSP-3β were expressed in Escherichia coli. The structural data of the MSP119 were obtained by molecular modeling based on the crystallographic coordinates of the P. cynomolgi MSP119. On the other hand, there is limited structural information available for MSP-3 family of Plasmodium. The analysis of the primary structure of these proteins indicates that they present a central alanine-rich domain organized as heptads repeats. This type of primary structure favors the formation of α-helices and coiled-coil (CC) structures. In the present study, the composition of the secondary structure of each recombinant protein was characterized preliminarily by circular dichroism monitored in the far-UV region. On the basis of the obtained results, we selected two recombinant proteins based on C-terminal region of the MSP-3α (CC4 and CC5) for detailed biophysical analyses. Initially, we demonstrated that the monomer mass assigned for the two recombinant proteins corresponded exactly to those predicted from the primary sequence. However, during size exclusion chromatography, the proteins eluted at volumes corresponding to molecular weights that were much larger than their monomeric masses, suggesting that both proteins are oligomeric molecules. Interestingly, analytical ultracentrifugation experiments showed that the CC5 oligomers are elongated molecules. As the function of these proteins is not known, the structural data obtained in this study can be used to understand the function of these proteins. In the second part of this study, we selected five recombinant proteins for comparative recognition by IgG antibodies of the individuais from endemic areas of malaria vivax. These studies confirmed previous data that the MSPs are imunogenic in natural infections. Together, our results suggest that, as well as the MSP119, that recombinant proteins based on the MSP-3α and MSP-3β can be explored in future studies for the induction of protective immunity against malaria vivax.