Le mélanome est une tumeur réputée radiorésistante. Ceci est conforté par ses caractéristiques radiobiologiques observées notamment in vitro. Le mélanocyte dont la transformation maligne engendre cette tumeur est le siège d’un métabolisme unique, la mélanogenèse. Celle-ci produit des pigments bien connus dans leur rôle de photoprotecteurs, mais leur éventuelle participation à une modulation de la sensibilité de ces cellules aux radiations ionisantes bien que suggérée dans la littérature, ne révèle que quelques résultats publiés criticables voire contradictoires. Notre travail s’est intéressé à préciser les rôles des pigments et du stress oxydant généré par les radiations ionisantes dans la modulation de la radiosensibilité du mélanocyte malin et d’en évaluer l’impact aussi bien sur la survie cellulaire, les lésions à l'ADN qu' aux processus de mort cellulaire. Nos résultats montrent que la nature du pigment, les eumélanines (pigment brun ou noir) en particulier ainsi que leur quantité influencent directement la radiosensibilité des cellules en terme de survie. Ceci a été démontré aussi bien en comparant des lignées cellulaires de pigmentation différentes qu’en stimulant cette dernière par son précurseur naturel, la tyrosine. D’autre part et d’une manière inattendue, l’altération de la barrière chimique cellulaire la plus importante que représentent les radioprotecteurs :Glutathion et son précurseur, Cystéine, semble favoriser la survie des mélanocytes malins au lieu d’en augmenter la radiosensibilité. Or, ces deux molécules sont aussi impliquées dans la mélanogenèse et entrent même dans la composition d’un type de pigments riches en soufre que sont les phaeomélanines. La mesure de la balance des deux types de pigments dans ces conditions nous a fourni un élément de réponse :en absence de GSH et surtout de Cys, l’eumélanogenèse a été favorisée en rejoignant ainsi nos premiers résultats concernant la manipulation des pigments. Nous avons également examiné les lésions immédiates à l’ADN occasionnées par l’irradiation dans les mêmes conditions que pour la survie cellulaire. Nos résultats montrent une protection significative de l’ADN lorsque la pigmentation est stimulée soit par la tyrosine, soit par déplétion de cystéine. Aussi une corrélation a pu être établie entre ces effets, l’aboutissement de l’apoptose radioinduite et la survie cellulaire. Enfin, nous nous sommes intéressés à la stimulation directe de la mélanogenèse par les radiations ionisantes. Nous avons observé un effet activateur dose-dépendant sur la tyrosinase, l’enzyme-clé de la pigmentation. Les mécanismes par lesquels les pigments, spécialement les eumélanines, agissent, pourraient être liés aux propriétés protectrices connues pour ces pigments comme pièges des radicaux libres. Cependant, une interaction directe des radiations avec le polymère solide, lui-même contenant des métaux lourds, n’est pas à écarter. En conclusion, les mélanines semblent fortement impliquées dans la modulation de la radiosensibilité du mélanocyte malin et peuvent compenser la perte des deux radioprotecteurs cellulaires les plus importants, le Glutathion et surtout la Cystéine. Est-ce qu’une stratégie consistant en l’inhibition de la formation de pigments trouverait sa place en radiothérapie du mélanome ?est une question ouverte par ce travail. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

no / Prohormone convertases (PCs) are endoproteases that process many substrates in addition to hormone precursors. Although overexpression of PCs is linked to carcinogenesis in some solid tumors, the role of subtilisin-kexin isoenzyme-1 (SKI-1) in this context is unknown. We show that SKI-1 is constitutively expressed in human pigment cells with higher SKI activity in seven out of eight melanoma cell lines compared with normal melanocytes. SKI-1 immunoreactivity is also detectable in tumor cells of melanoma metastases. Moreover, tissue samples of the latter display higher SKI-1 mRNA levels and activity than normal skin. From various stimuli tested, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate and tunicamycin affected SKI-1 expression. Importantly, SKI-1 inhibition by the cell-permeable enzyme inhibitor decanoyl-RRLL-chloromethylketone (dec-RRLL-CMK) not only suppressed proliferation and metabolic activity of melanoma cells in vitro but also reduced tumor growth of melanoma cells injected intracutaneously into immunodeficient mice. Mechanistic studies revealed that dec-RRLL-CMK induces classical apoptosis of melanoma cells in vitro and affects expression of several SKI-1 target genes including activating transcription factor 6 (ATF6). However, ATF6 gene silencing does not result in apoptosis of melanoma cells, suggesting that dec-RRLL-CMK induces cell death in an ATF6-independent manner. Our findings encourage further studies on SKI-1 as a potential target for melanoma therapy.

O melanoma representa 4% dos tipos de neoplasias cutâneas e causa 79% de morte por doenças de pele no mundo. Um dos grandes problemas relacionados ao tratamento de melanoma advém da sua resistência às terapias convencionais e, assim, a terapia fotodinâmica surgiu como uma alternativa terapêutica promissora, devido ao seu papel no tratamento de diversos tipos de câncer, além de outras doenças de pele. Ela é baseada no acúmulo seletivo de uma molécula fotoativa no tecido alvo, seguida da iluminação por uma fonte de luz, cujo comprimento de onda é específico para a excitação dessa molécula, ocasionando no dano celular. Neste estudo, foram realizados experimentos in vitro investigando a resposta fotodinâmica em melanoma humano, através de um modelo de tumor tridimensional por levitação magnética. Inicialmente, um protocolo de obtenção dos tumores de melanoma foi desenvolvido para avaliação da terapia em diferentes doses de luz e concentrações de fotossensibilizador. Em seguida, ensaios de cinética e quantificação intracelular com dois fotossensibilizadores, Photogem® e Photodithazine®, também foram feitos com o intuito de averiguar a sua distribuição, bem como tempo de internalização nos tumores. Tendo estabelecido que a incubação por 16 horas com Photodithazine® foi o parâmetro experimental mais adequado, a terapia fotodinâmica foi realizada, em sessão única, com irradiação em 660 nm em tumores de duas diferentes espessuras. Logo, testes de citotoxicidade foram utilizados para comparar os resultados de ambas as condições, onde se notou que o aumento na espessura atenuou o dano oxidativo decorrente da terapia. Além disso, foi observado que o acréscimo na dose de luz não acarretou em mudanças muito significativas na morte celular. No entanto, o maior dano celular, de aproximadamente 90% de morte, foi obtido com 100 μg/mL de Photodithazine® e iluminação com 60 J/cm², resultando na desagregação dos tumores, efeitos promissores da terapia no melanoma. Uma possível alternativa sugerida para aprimorar a eficiência fotodinâmica, seria a aplicação de mais sessões de terapia fotodinâmica, uma vez que os experimentos realizados nesse trabalho foram com uma sessão e, esse procedimento, poderia ocasionar em maior morte celular. / Melanoma accounts for 4% of skin cancers and causes 79% of death from skin diseases worldwide. A major problem associated with melanoma treatment is due to its increasingly resistance to conventional therapies. Thus, photodynamic therapy has emerged as a promising alternative modality to several types of cancer and other skin disorders. It generally involves the selective accumulation of a photoactive molecule in target tissue, followed by illumination with light source of an appropriate wavelength, to excite this molecule, resulting in cell damage. This study sought to investigate the photodynamic response in human melanoma, through a three dimensional tumor model by magnetic levitation. Initially, a protocol to obtain melanoma tumors was developed, to evaluate the therapy at different doses of light and photosensitizer concentrations. Posteriorly, kinetic assays and intracellular quantification with two photosensitizers, Photogem® and Photodithazine®, were also carried out in order to ascertain its distribution, as well as time internalization in tumors. Having established that incubation for 16 hours with Photodithazine® was the most suitable experimental parameter, photodynamic therapy was performed in a single session, with irradiation of 660 nm in two tumors, different in thicknesses. Therefore, cytotoxicity tests were used to compare the results of both conditions, where it was noted that the increased tumor depth may attenuate oxidative damage, induced by the therapy. Furthermore, it was observed that the increase in light dose did not result in significant changes in cell death. Nevertheless, the greater cell damage, approximately 90% kill was obtained with 100 ug/mL Photodithazine® and illumination with 60 J / cm², causing tumor breakdown, which is a promising effect in melanoma therapy. An alternative suggested to enhance the photodynamic efficiency, would be to apply more sessions of photodynamic therapy, so this procedure could result in increased cell death.

O melanoma representa 4% dos tipos de neoplasias cutâneas e causa 79% de morte por doenças de pele no mundo. Um dos grandes problemas relacionados ao tratamento de melanoma advém da sua resistência às terapias convencionais e, assim, a terapia fotodinâmica surgiu como uma alternativa terapêutica promissora, devido ao seu papel no tratamento de diversos tipos de câncer, além de outras doenças de pele. Ela é baseada no acúmulo seletivo de uma molécula fotoativa no tecido alvo, seguida da iluminação por uma fonte de luz, cujo comprimento de onda é específico para a excitação dessa molécula, ocasionando no dano celular. Neste estudo, foram realizados experimentos in vitro investigando a resposta fotodinâmica em melanoma humano, através de um modelo de tumor tridimensional por levitação magnética. Inicialmente, um protocolo de obtenção dos tumores de melanoma foi desenvolvido para avaliação da terapia em diferentes doses de luz e concentrações de fotossensibilizador. Em seguida, ensaios de cinética e quantificação intracelular com dois fotossensibilizadores, Photogem® e Photodithazine®, também foram feitos com o intuito de averiguar a sua distribuição, bem como tempo de internalização nos tumores. Tendo estabelecido que a incubação por 16 horas com Photodithazine® foi o parâmetro experimental mais adequado, a terapia fotodinâmica foi realizada, em sessão única, com irradiação em 660 nm em tumores de duas diferentes espessuras. Logo, testes de citotoxicidade foram utilizados para comparar os resultados de ambas as condições, onde se notou que o aumento na espessura atenuou o dano oxidativo decorrente da terapia. Além disso, foi observado que o acréscimo na dose de luz não acarretou em mudanças muito significativas na morte celular. No entanto, o maior dano celular, de aproximadamente 90% de morte, foi obtido com 100 μg/mL de Photodithazine® e iluminação com 60 J/cm², resultando na desagregação dos tumores, efeitos promissores da terapia no melanoma. Uma possível alternativa sugerida para aprimorar a eficiência fotodinâmica, seria a aplicação de mais sessões de terapia fotodinâmica, uma vez que os experimentos realizados nesse trabalho foram com uma sessão e, esse procedimento, poderia ocasionar em maior morte celular. / Melanoma accounts for 4% of skin cancers and causes 79% of death from skin diseases worldwide. A major problem associated with melanoma treatment is due to its increasingly resistance to conventional therapies. Thus, photodynamic therapy has emerged as a promising alternative modality to several types of cancer and other skin disorders. It generally involves the selective accumulation of a photoactive molecule in target tissue, followed by illumination with light source of an appropriate wavelength, to excite this molecule, resulting in cell damage. This study sought to investigate the photodynamic response in human melanoma, through a three dimensional tumor model by magnetic levitation. Initially, a protocol to obtain melanoma tumors was developed, to evaluate the therapy at different doses of light and photosensitizer concentrations. Posteriorly, kinetic assays and intracellular quantification with two photosensitizers, Photogem® and Photodithazine®, were also carried out in order to ascertain its distribution, as well as time internalization in tumors. Having established that incubation for 16 hours with Photodithazine® was the most suitable experimental parameter, photodynamic therapy was performed in a single session, with irradiation of 660 nm in two tumors, different in thicknesses. Therefore, cytotoxicity tests were used to compare the results of both conditions, where it was noted that the increased tumor depth may attenuate oxidative damage, induced by the therapy. Furthermore, it was observed that the increase in light dose did not result in significant changes in cell death. Nevertheless, the greater cell damage, approximately 90% kill was obtained with 100 ug/mL Photodithazine® and illumination with 60 J / cm², causing tumor breakdown, which is a promising effect in melanoma therapy. An alternative suggested to enhance the photodynamic efficiency, would be to apply more sessions of photodynamic therapy, so this procedure could result in increased cell death.

La dissémination métastatique est associée à de faibles chances de survie dans les cas de mélanomes humains, comme pour d’autres cancers. Le développement de métastases est un processus qui se fait en plusieurs étapes et nécessite la réorganisation du cytosquelette d’actine pour permettre la migration et l’invasion cellulaire. La protéine Nck2 est un adaptateur protéique principalement impliqué dans la réorganisation du cytosquelette. Une étude préliminaire réalisée dans notre laboratoire avait révélé que les niveaux de la protéine Nck2 et de son ARNm sont augmentés dans les lignées de mélanome métastatiques en comparaison aux lignées primaires. Le but de la présente recherche était donc d’étudier le rôle de l’adaptateur Nck2 dans la progression métastatique. Les résultats obtenus confirment que l’expression de Nck2 augmente de façon marquée au cours de la progression métastatique du mélanome humain. Cette étude révèle en plus que l’expression de hauts niveaux de Nck2 dans les cellules de mélanome primaire stimule la prolifération cellulaire et la migration, n’affecte pas l’invasion d’une matrice de collagène de type I, mais semble affaiblir les contacts cellule-cellule et l’adhésion au substrat. Une étude préliminaire effectuée in vivo révèle que ces phénomènes se traduisent par une légère augmentation de la tumorigenèse et de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, les résultats obtenus suggèrent que Nck2 pourrait effectivement jouer un rôle dans la progression métastatique du mélanome en favorisant la prolifération des cellules tumorales et en facilitant leur détachement de la tumeur primaire, les rendant plus aptes à se disperser dans l’organisme et à établir des colonies métastatiques. Au niveau moléculaire, nous proposons que Nck2 est recruté dans les invadopodes pour favoriser la formation de complexes protéiques qui stimulent l’invasion. La mobilisation de Nck2 dans ces structures membranaires diminuerait sa disponibilité pour l’établissent d’autres complexes protéiques, entre autres dans les complexes d’adhésion focaux (FAs) et dans les jonctions adhérentes, diminuant ainsi les contacts des cellules cancéreuses avec la matrice extracellulaire et les cellules avoisinantes. / The metastatic process is highly fatal in many cancers, including human melanoma. Metastatic progression is a multistep process in which cytoskeletal organization allows migration and invasion of cancer cells. Nck2 is an adaptor protein mainly associated with cytoskeletal organization. A preliminary study carried out in our laboratory has shown that Nck2 protein and mRNA levels are increased in metastatic melanoma cell lines compared to primary cell lines. In this study, the role of Nck2 in metastatic progression was further investigated. Results confirmed that Nck2 levels are increased in metastatic melanoma compared to primary cell lines. Nck2 overexpression in primary melanoma induced migration and cell proliferation, did not affect invasion in type I collagen matrix, but decreased cell-cell and cell-substrate adhesion. In addition, a preliminary in vivo study suggested that Nck2 overexpression slightly increased tumorigenesis and tumor growth in primary melanoma. All together, these results indicate that Nck2 may effectively influence metastatic progression of melanoma by increasing cancer cell proliferation and detachment from the primary tumor, allowing them to enter the blood circulation and form distant colonies. At the molecular level, we propose that Nck2 is recruited to invadopodia in order to form molecular complexes that increase cell invasion, and this may results in a decrease in Nck2 levels available to form other molecular complexes in others cell compartments, such as focal adhesions (FA) and adherent cell junctions.

La dissémination métastatique est associée à de faibles chances de survie dans les cas de mélanomes humains, comme pour d’autres cancers. Le développement de métastases est un processus qui se fait en plusieurs étapes et nécessite la réorganisation du cytosquelette d’actine pour permettre la migration et l’invasion cellulaire. La protéine Nck2 est un adaptateur protéique principalement impliqué dans la réorganisation du cytosquelette. Une étude préliminaire réalisée dans notre laboratoire avait révélé que les niveaux de la protéine Nck2 et de son ARNm sont augmentés dans les lignées de mélanome métastatiques en comparaison aux lignées primaires. Le but de la présente recherche était donc d’étudier le rôle de l’adaptateur Nck2 dans la progression métastatique. Les résultats obtenus confirment que l’expression de Nck2 augmente de façon marquée au cours de la progression métastatique du mélanome humain. Cette étude révèle en plus que l’expression de hauts niveaux de Nck2 dans les cellules de mélanome primaire stimule la prolifération cellulaire et la migration, n’affecte pas l’invasion d’une matrice de collagène de type I, mais semble affaiblir les contacts cellule-cellule et l’adhésion au substrat. Une étude préliminaire effectuée in vivo révèle que ces phénomènes se traduisent par une légère augmentation de la tumorigenèse et de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, les résultats obtenus suggèrent que Nck2 pourrait effectivement jouer un rôle dans la progression métastatique du mélanome en favorisant la prolifération des cellules tumorales et en facilitant leur détachement de la tumeur primaire, les rendant plus aptes à se disperser dans l’organisme et à établir des colonies métastatiques. Au niveau moléculaire, nous proposons que Nck2 est recruté dans les invadopodes pour favoriser la formation de complexes protéiques qui stimulent l’invasion. La mobilisation de Nck2 dans ces structures membranaires diminuerait sa disponibilité pour l’établissent d’autres complexes protéiques, entre autres dans les complexes d’adhésion focaux (FAs) et dans les jonctions adhérentes, diminuant ainsi les contacts des cellules cancéreuses avec la matrice extracellulaire et les cellules avoisinantes. / The metastatic process is highly fatal in many cancers, including human melanoma. Metastatic progression is a multistep process in which cytoskeletal organization allows migration and invasion of cancer cells. Nck2 is an adaptor protein mainly associated with cytoskeletal organization. A preliminary study carried out in our laboratory has shown that Nck2 protein and mRNA levels are increased in metastatic melanoma cell lines compared to primary cell lines. In this study, the role of Nck2 in metastatic progression was further investigated. Results confirmed that Nck2 levels are increased in metastatic melanoma compared to primary cell lines. Nck2 overexpression in primary melanoma induced migration and cell proliferation, did not affect invasion in type I collagen matrix, but decreased cell-cell and cell-substrate adhesion. In addition, a preliminary in vivo study suggested that Nck2 overexpression slightly increased tumorigenesis and tumor growth in primary melanoma. All together, these results indicate that Nck2 may effectively influence metastatic progression of melanoma by increasing cancer cell proliferation and detachment from the primary tumor, allowing them to enter the blood circulation and form distant colonies. At the molecular level, we propose that Nck2 is recruited to invadopodia in order to form molecular complexes that increase cell invasion, and this may results in a decrease in Nck2 levels available to form other molecular complexes in others cell compartments, such as focal adhesions (FA) and adherent cell junctions.

A vasculatura tumoral é estrutural e funcionalmente anormal em relação à vasculatura de órgãos normais, resultando em regiões de heterogeneidade intratumoral para concentração de oxigênio, nutrientes e células inflamatórias. Com isso a vascularização disfuncional muitas vezes leva à administração ineficiente de drogas, comprometendo portanto a eficácia do tratamento. Recentemente, foi demonstrado que terapias antiangiogênicas e exercícios físicos poderiam \"normalizar\" a vasculatura tumoral, melhorando a sobrevida em pacientes com câncer. No entanto seria importante analisar se em melanomas portadores da mutação BRAFV600E, que são altamente resistentes a terapia, se o exercício promoveria a normalização vascular. Este trabalho teve como objetivo analisar o impacto do exercício físico voluntário na função vascular de melanomas humanos com mutação BRAFV600E em camundongos imunodeficientes (BALB/c Nude). Em relação ao crescimento tumoral, não observamos diferenças significativas entre os grupos dos animais exercitados e sedentários, tampouco diferença nos níveis de expressão de genes característicos de macrófagos M1 e M2 no microambiente tumoral desses animais. Por outro lado, a análise de expressão de genes nas células tumorais demonstrou que 8 genes foram diferencialmente expressos no Grupo exercitado ( < 4 km) em relação ao Grupo Sedentário, dentre os quais: FLOT2, STK4, STAT3, LATS1, PTEN, MCL1, PCNA e ACTA2. Em adição, não observamos diferenças significativas no percentual de área necrótica, hipóxica e vasos CD31 positivos. Desse modo, concluímos que o exercício físico induz um aumento nos níveis de expressão de genes envolvidos em modificações epigenéticas, apoptose, proliferação e sobrevivência, ciclo celular e motilidade célula / The tumor vasculature is structurally and functionally abnormal in relation to the vasculature of normal organs, resulting in regions of intratumoral heterogeneity for oxygen parcial pressure, nutrients and inflammatory cells. Thus dysfunctional vascularization often leads to inefficient drug delivery, thereby compromising the efficacy of treatment. Recently, it has been demonstrated that anti-angiogenic therapies and physical exercises could \"normalize\" tumor vasculature, improving survival in patients with cancer. However, it would be important to analyze in BRAFV600E melanoma tumors, which are highly resistant to therapy, whether exercise would promote vascular normalization. Based on this, this work aimed to analyze the impact of voluntary physical exercise on the vascular function of human melanomas with BRAFV600E mutation in immunodeficient mice (BALB / c Nude). In relation to the tumor growth, we did not observe significant differences between the groups of the exercised and sedentary animals, neither difference in the expression levels of genes characteristic of M1 and M2 macrophages in the tumor microenvironment of these animals. On the other hand, analysis of gene expression in tumor cells showed that 8 genes were differentially expressed in the exercised group ( < 4 km) in comparision to the Sedentary Group, among them: FLOT2, STK4, STAT3, LATS1, PTEN, MCL1, PCNA and ACTA2. In addition, we did not observe any significant differences in the percentage of necrotic, hypoxic area and CD31 positive vessels. Thus, we concluded that physical exercise induces an increase in the expression levels of genes involved in epigenetic modifications, apoptosis, proliferation and survival, cell cycle and cell motility

O melanoma maligno é o tipo de câncer de pele com pior prognóstico, devido à sua elevada probabilidade de causar metástases. Atualmente existem poucos tratamentos efetivos para o tratamento do melanoma, sendo que a sobrevida de pacientes que apresentam metástases é muito baixa, em torno de 8 meses, sendo que as taxas de cura nestas condições não ultrapassam 1%. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica seletiva e não invasiva, que vem demonstrando excelentes resultados clínicos no tratamento de tumores de pele do tipo não melanoma, como carcinoma espino e basocelular. O trabalho em questão aborda a efetividade da TFD, em linhagens humana de melanoma em diferentes fases de progressão da neoplasia, desde os estágios iniciais da doença (células de crescimento radial - RGP), até a fase metastática, não só em cultura de células em monocamada (2D), como também através do desenvolvimento de modelos celulares tridimensionais (3D), mistos ou não com fibroblastos humano, cuja proposta é mimetizar in vitro as reais condições de tumorigênese existentes in vivo, tais como o contato célula-célula entre as linhagens neoplásicas e os fibroblastos da derme, o contato célula-matriz extracelular (matriz de colágeno), além de propiciar o crescimento tumoral de forma livre de adesão ao substrato, o que é característico dos processos malignos. Em uma primeira etapa, o fármaco fotossensível Ftalocianina de Cloroalumínio (AlClPc) foi escolhido como agente fotossensibilizante utilizado nos estudos, sendo este encapsulado em vesículas lipossomais, propiciando a solubilidade do composto em meio aquoso, otimizando sua entrada nas células. As propriedades fotoquímicas e fotofísicas da formulação lipossomal foram avaliadas, garantindo que a encapsulação não interfere na capacidade fotodinâmica do agente. Como segunda etapa, a formulação foi testada nos modelos celulares 2D e 3D acima descritos, realizando-se não só estudos de toxicidade, mas também ensaios de morte celular (apoptose versus necrose), incorporação intracelular do fármaco (uptake), de forma quantitativa e também qualitativa, demonstrando a localização intracelular preferencial do fármaco. Tanto em culturas 2D como em culturas 3D, a formulação AlClPc lipossomal apresentou atividade farmacológica superior aos sistemas aplicáveis em TFD, já descritos na literatura, o que abre caminhos para a realização de estudos in vivo em animais com boas perspectivas de resposta ao tratamento do melanoma humano, com possibilidades de futuras aplicações clínicas. / Melanoma is the type of skin cancer with poor prognosis due to its high probability of suffering metastases. Currently there are few effective treatments for the this, and the survival of patients with metastases is very low, around 8 months, with cure rates of these conditions do not exceed 1%. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality selective and non-invasive, it has shown excellent clinical results in the treatment of non-melanoma skin cancers such as squamous and basal cell carcinoma. This work discusses the effectiveness of PDT in human melanoma cell lines in different stages of tumor progression, from the early stages of the disease (radial growth phase cells - RGP), to the metastatic stage, not only in cell culture in monolayer (2D), but also through the development of three-dimensional cellular models (3D), mixed or not with human fibroblasts, which aims to mimic in vitro, the real conditions existing in in vivo tumorigenesis, such as cell-cell contact between cancer cell lines and fibroblasts of the dermis, the contact cell-extracellular matrix (collagen matrix), as well as futher the growth of the tumor cells free from the substrate adhesion, which is characteristic of malignant processes. In a first step, the photosensitizer Cloroaluminum Phthalocyanine (AlClPc) was chosen to be used in the studies, which is encapsulated in liposomal vesicles, allowing the solubility of the drug in water, optimizing its intracellular incorporation. Furthermore, the photochemical and photophysical properties of the liposomal formulation were evaluated, ensuring that the encapsulation does not interfere with its photodynamic activity. As a second step, the formulation was tested in cellular models 2D and 3D above described, performing not only toxicity, but assays of cell death (apoptosis versus necrosis), intracellular drug incorporation (uptake), both quantitative and also qualitative, showing the main intracellular localization of the photosensitizer. Both in 2D cultures and 3D cultures, the liposomal AlClPc showed better pharmacological activity than the current applied PDT protocols, already described in the literature, and this is an open field for in vivo studies with animals with good prospects for responses to the treatment of human melanoma with possibilities for future clinical applications.

O melanoma maligno é o tipo de câncer de pele com pior prognóstico, devido à sua elevada probabilidade de causar metástases. Atualmente existem poucos tratamentos efetivos para o tratamento do melanoma, sendo que a sobrevida de pacientes que apresentam metástases é muito baixa, em torno de 8 meses, sendo que as taxas de cura nestas condições não ultrapassam 1%. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica seletiva e não invasiva, que vem demonstrando excelentes resultados clínicos no tratamento de tumores de pele do tipo não melanoma, como carcinoma espino e basocelular. O trabalho em questão aborda a efetividade da TFD, em linhagens humana de melanoma em diferentes fases de progressão da neoplasia, desde os estágios iniciais da doença (células de crescimento radial - RGP), até a fase metastática, não só em cultura de células em monocamada (2D), como também através do desenvolvimento de modelos celulares tridimensionais (3D), mistos ou não com fibroblastos humano, cuja proposta é mimetizar in vitro as reais condições de tumorigênese existentes in vivo, tais como o contato célula-célula entre as linhagens neoplásicas e os fibroblastos da derme, o contato célula-matriz extracelular (matriz de colágeno), além de propiciar o crescimento tumoral de forma livre de adesão ao substrato, o que é característico dos processos malignos. Em uma primeira etapa, o fármaco fotossensível Ftalocianina de Cloroalumínio (AlClPc) foi escolhido como agente fotossensibilizante utilizado nos estudos, sendo este encapsulado em vesículas lipossomais, propiciando a solubilidade do composto em meio aquoso, otimizando sua entrada nas células. As propriedades fotoquímicas e fotofísicas da formulação lipossomal foram avaliadas, garantindo que a encapsulação não interfere na capacidade fotodinâmica do agente. Como segunda etapa, a formulação foi testada nos modelos celulares 2D e 3D acima descritos, realizando-se não só estudos de toxicidade, mas também ensaios de morte celular (apoptose versus necrose), incorporação intracelular do fármaco (uptake), de forma quantitativa e também qualitativa, demonstrando a localização intracelular preferencial do fármaco. Tanto em culturas 2D como em culturas 3D, a formulação AlClPc lipossomal apresentou atividade farmacológica superior aos sistemas aplicáveis em TFD, já descritos na literatura, o que abre caminhos para a realização de estudos in vivo em animais com boas perspectivas de resposta ao tratamento do melanoma humano, com possibilidades de futuras aplicações clínicas. / Melanoma is the type of skin cancer with poor prognosis due to its high probability of suffering metastases. Currently there are few effective treatments for the this, and the survival of patients with metastases is very low, around 8 months, with cure rates of these conditions do not exceed 1%. Photodynamic therapy (PDT) is a therapeutic modality selective and non-invasive, it has shown excellent clinical results in the treatment of non-melanoma skin cancers such as squamous and basal cell carcinoma. This work discusses the effectiveness of PDT in human melanoma cell lines in different stages of tumor progression, from the early stages of the disease (radial growth phase cells - RGP), to the metastatic stage, not only in cell culture in monolayer (2D), but also through the development of three-dimensional cellular models (3D), mixed or not with human fibroblasts, which aims to mimic in vitro, the real conditions existing in in vivo tumorigenesis, such as cell-cell contact between cancer cell lines and fibroblasts of the dermis, the contact cell-extracellular matrix (collagen matrix), as well as futher the growth of the tumor cells free from the substrate adhesion, which is characteristic of malignant processes. In a first step, the photosensitizer Cloroaluminum Phthalocyanine (AlClPc) was chosen to be used in the studies, which is encapsulated in liposomal vesicles, allowing the solubility of the drug in water, optimizing its intracellular incorporation. Furthermore, the photochemical and photophysical properties of the liposomal formulation were evaluated, ensuring that the encapsulation does not interfere with its photodynamic activity. As a second step, the formulation was tested in cellular models 2D and 3D above described, performing not only toxicity, but assays of cell death (apoptosis versus necrosis), intracellular drug incorporation (uptake), both quantitative and also qualitative, showing the main intracellular localization of the photosensitizer. Both in 2D cultures and 3D cultures, the liposomal AlClPc showed better pharmacological activity than the current applied PDT protocols, already described in the literature, and this is an open field for in vivo studies with animals with good prospects for responses to the treatment of human melanoma with possibilities for future clinical applications.