Dans le but de caractériser les conditions environnementales, hydrologiques et d’usage des sols, menant à la contamination d’un système karstique cette étude combine hydrogéologie et microbiologie environnementale. Les chroniques de température et d’hydrologie (pluviométrie, turbidité, conductivité) de l’hydrosystème karstique de Norville (SO Karst) des 5 dernières années ont été analysées pour trouver une corrélation entre les conditions hydrologiques menant au ruissellement sur le bassin versant et la contamination par E. coli de l’hydrosystème (eau et biofilms). Quinze campagnes de prélèvement d’eau à l’entrée (la perte) et la sortie (la source) du système et de biofilms ont été réalisées. La relation entre l’abondance et la diversité génétique (distribution des phylogroupes) des populations de E. coli circulant dans l’hydrosystème et les conditions hydrologiques et d’usage des sols a été étudiée. Un indicateur de contamination des eaux par E. coli (IndiCE) basé sur l’enregistrement de la température et la pluviométrie et corrélé avec la contamination d’eau de surface et sous terraine par E. coli d’un hydrosystème karstique, simple d’utilisation est proposé. Le rôle de réservoir de pathogène des biofilms karstiques, responsable de contamination secondaire, a été étudié en suivant l’occurrence de E. coli et des intégrons de classe 1 dans des biofilms formés à la source de l’hydrosystème karstique de Norville.Il a été montré en chemostat la capacité de E. coli à former des biofilms sur la craie en condition oligotrophique. In situ E. coli et les integrons de classe 1 peuvent s’associer à des biofilms autochtones sous forme cultivable transitoirement. L’ensemble de ces travaux de thèse a permis de mieux comprendre la dynamique de la contamination par E. coli des hydrosystèmes karstiques, dans l’eau et les biofilms. / In order to assess environmental conditions leading to contamination of a rural karstic hydrosystem this study combine hydrogeology, and environmental microbiology. We focused on a well-characterized chalk karstic hydrosystem (Norville, France) vulnerable to microbiological pollution, of the French national observatory network on karst (INSU/CNRS). Temperature and hydrological time series (pluviometry, turbidity and electrical conductivity) over the past 5 years were analysed in order to correlate hydrological condition leading to run-off on the watershed and E. coli contamination of the hydrosystem. Fifteen sampling campaigns of water and biofilms were carried out in different hydrological conditions, on the surficial watershed (i.e. the upstream part of the system) and at the spring downstream. That has been used to determine periods more subject to soil bacteria leaching and input in the hydrosystem. Finally, relationships between abundance and genetic diversity (phylogroup distribution) of E. coli population in the hydrosystem waters, hydrological conditions and land use were investigated. An hydrological indicator (IndiCE) based on the analysis of pluviometry, conductivity, turbidity and temperature time series has been constructed to assess the vulnerability of such karstic hydrosystem to E. coli contamination according to hydrological conditions. The role of karstic biofilm as pathogens reservoir and class 1 integrons, responsible of secondary contamination, has been studied recording E.coli occurrence in karstic biofilms sampled at Norville’s spring. It has been showed in reactor E. coli capacity to form biofilms on chalk in oligotrophic conditions. In situ cultivable E. coli and class 1 integrons can integrate autochthonous biofilms transiently. E. coli population structure in biofilms is significantly the same than in spring water. This thesis work allowed to a better understanding of E. coli contamination dynamic in water and biofilm of karstic hydrosystem.