Orientador: Anibal Eugenio Vercesi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-09-11T21:10:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Velho_JesusAntonio_D.pdf: 7243183 bytes, checksum: e41359a2677f40435f99f0f40830ee99 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Resultados recentes do nosso grupo demonstram que mitocôndrias de camundongos hipercolesterolêmicos por deficiência do receptor de LDL (LDLR-1-) apresentam uma baixa capacidade antioxidante em função do alto consumo de NADPH para sustentar elevadas taxas de lipogênese (Oliveira et al., FASEB J. 19: 278-280; 2005). Neste trabalho, o estresse oxidativo mitocondrial dos camundongos LDLK-/- foi caracterizado, mostrando uma diminuição da razão GSH/GSSG e altos níveis de grupos carbonilas protéicos quando comparado com camundongos controles. Não foram encontradas diferenças significativas na atividade do sistema antioxidante glutationa peroxidase/redutase. Catalase exógena preveniu a oxidação espontânea de NAD(p)H endógeno em mitocôndrias isoladas de camundongos LDLR-/-, indicando que esta oxidação é mediada por 'H IND. 2' 'O IND. 2' gerado pela mitocôndria. A alta taxa de liberação de 'H IND. 2' 'O IND. 2' por mitocôndrias de camundongos LDLR-/- também foi previnida na presença de rotenona e isocitrato exógeno, os quais mantém o conteúdo endógeno de NAD(p) completamente reduzido. A nossa hipótese de que altas taxas de lipogênese diminuem a razão NADPH/NADP+ devido à redução do conteúdo de substratos ligados ao NADP é suportada pela observação de que o consumo de oxigênio mantido por substratos endógenos foi menor em mitocôndrias de camundongos LDLR-/- quando comparado com mitocôndrias controles, mas foi similar na presença de isocitrato exógeno. De fato, os níveis mitocondriais de isocitrato foram significativamente menores em camundongos LDLK-/-. Na segunda parte do trabalho, nós utilizamos estatinas (inibidores da 3- hidróxi-3-metilglutaril CoA redutase) na tentativa de corrigir o estresse oxidativo observado em camundongos LDLR-/-, mas descobrimos que o tratamento com a lovastatina piora este efeito. Mitocôndrias isoladas de figado de camundongos LDLR-/- tratados durante 15 dias com doses terapêuticas (100 mg/kg, v.o.) de lovastatina apresentaram uma maior susceptibilidade para desenvolver transição de permeabilidade mitocondrial (TPM). Em experimentosin vitro, lovastatinainduziuTPM de forma dose-dependente (10-80 'mu'M) por um mecanismo sensível a ciclosporina A (inibidor de ciclofilina), ditiotreitol (agente redutor), ADP (inibidor do translocador de nucleotídeo de adenina), catalase (redutor de 'H IND. 2' 'O IND. 2') e EGTA (quelante de cálcio). Em concordância com a inibição do inchamento mitocondrial por ditiotreitol, a lovastatina também diminuiu o conteúdo de grupos tiólicos de proteínas de membrana. Sinvastatina teve efeitos similares a lovastatina sobre as mitocôndrias; entretanto a pravastatina, uma estatina hidrofilica, apresentou menor capacidade de induzir a TPM. Estes resultados demonstram que estatinas podem atuar diretamente na mitocôndria tanto in vivo quanto in vitro induzindo transição de permeabilidade, que é um processo envolvido na morte celular / Abstract: Recent results from our group demonstrated that hypercholesterolemic LDL receptor knockout (LDLR-/-) mice mitochondria possess a lower antioxidant capacity due to a large consumption of reducing equivalents from NADPH to sustain high rates of lipogenesis (Oliveira et al., FASEB J.; 19: 278-280; 2005). In this work, LDLR-/- mice oxidative stress was further characterized by showing a lower mitochondrial GSH/GSSG ratio and a higher liver content of protein carbonyls as compared to control mice. No differences in the activity of the antioxidant enzyme system glutathione reductase/peroxidase was observed. Exogenous catalase prevented the spontaneous oxidation of endogenous NAD(p)H in mitochondria isolated from LDLR-/- mice, indicating that this oxidation is mediated by mitochondrial generated 'H IND. 2' 'O IND. 2'. The higher rate of 'H IND. 2' 'O IND. 2' release in LDLK/- mitochondria was also prevented by the presence of exogenous isocitrate and rotenone, which maintain NADP fully reduced. Our hypothesis that high rates of lipogenesis decreases NADPH/NADP+ ratio due to a decreased content of NADP-linked substrates is supported by observations that oxygen consumption supported by endogenous substrates was lower in LDLR-/- mice than in control mitochondria, but was similar in the presence of exogenous isocitrate. Indeed, endogenous mitochondriallevels of isocitrate were significantly lower in LDLK-/- mice. ln the second part ofthis work, we used statins (3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase inhibitors) in an attempt to Correct the oxidative stress observed in LDLK-/- mice, but we found that the drug treatment worsened this defect. We report here that liver mitochondria isolated from hypercholesterolemic LDL receptor knockout mice treated during 15 days with therapeutic doses (100 mg/kg, p.o.) of lovastatin presented a higher susceptibility to develop membrane permeability transition (MPT). In experiments in vitro, lovastatin induced MPT in a dose-dependent manner (10-80 'mu' M) by a mechanism sensitive to cyclosporin A (cyclophilin inhibitor), dithiothreitol (reducing agent), ADP (adenine nucleotide carrier inhibitor), catalase ('H IND. 2' 'O IND. 2' reductant) and EGTA (calcium chelator). In agreement with the inhibition of the mitochondrial swelling by dithiothreitol, lovastatin also decreased the content of total mitochondrial membrane protein thiol groups. Simvastatin had similar effects on mitochondria; however, pravastatin, a hydrophilic statin, had a weaker effect in inducing MPT. These results demonstrate that statins can act directly on mitochondria either in vivo or in vitro inducing permeability transition, which is a process involved in cell death / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica