Made available in DSpace on 2015-03-26T13:36:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3012323 bytes, checksum: 96e79a49116ebbc5c759193ecd754c2b (MD5) Previous issue date: 2006-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plants propagated in vitro are usually affected by stress conditions, which can lead to the hyperhydricity development. In this sense, this study was carried out to investigate the influence of the gelling agents, cytokinin-6-benzylaminopurine (BAP) and type of the flask sealing upon the induction of hyperhydricity in grapevine and strawberry plants. So, strawberry plants Dover and Burkley and the rootstock of the grapevine 'VR043 - 43', kept in vitro in growth room at 25 ± 2 ºC, under a 16-hour photoperiod and irradiance 36 µmol m-2 s-1. Strawberry explants were cultivated in medium containing salts and vitamins of MS, 30 g L-1 sucrose, 100 mg L-1 myo-inositol added with Agar (6.5 g L-1) or Phytagel® (2.5 g L-1) and BAP at different concentrations (0.5; 1.0; 2.0 and 3.0 mg L-1). Some grapevine internodes were transferred to MS/2 or to Q & L medium, with the same amounts of sucrose and myo-inositol added with Agar (6.5 g L-1) or Phytagel® (2,5 g L-1) and BAP (1.0 or 2.0 mg L-1). The ethylene levels were measured inside the flasks at 5, 10, 20, and 30 days under culture for strawberry plant, as well as at 3, 7, 14, 20, 30 and 40 days for grapevine. After 35 days, the following analyses were accomplished: biochemistry (SOD, CAT, POD, isozymes, lipid peroxidation, chlorophyll content), structural (light microscopy and scanning electron microscopy), besides the morphologic characteristics of the hyperhydricity. To study the influence of the sealing upon the development of hyperhydricity, the grapevine and strawberry plants were transferred to flasks containing both inductor and noninductor medium of hyperhydricity. The flasks were sealed with either rigid polypropylene lid with and without membrane permeable to gaseous exchanges or two layers of plastic PVC film. The ethylene levels were measured at 7, 20 and 40 days under culture. After 35 days, the following were analyzed: fresh and dry matter of the buds, lipid peroxidation, enzymatic systems MDH, ADH and POD, electrolyte leakage, and ultra-structural characteristics (scanning). The BAP addition to the culture medium induced the oxidative stress, which caused changes in the physiologic state of both strawberry and grapevine plants, that were characterized by increase in either the activity of antioxidant enzymes and the peroxidation of lipids, alterations at cellular level, malformations in stomata and epidermal cells, besides increased production ethylene inside the culture flasks. The sealing type affected the internal ambient of the flasks, therefore the hyperhydricity development. In the flasks sealed with permeable membrane, even in hyperhydricity inducing medium, no morphologic characteristics of such a phenomenon were observed, although an increase in both peroxidase activity and electrolyte leakage were observed in the grapevine plants submitted to this treatment. The sealing of the flasks with rigid polypropylene lid or with PVC film, in presence of BAP, promoted higher hyperhydricity index, therefore confirming that the sealing type of the flasks associated to the components of the medium and culture conditions are related to the appearance of this physiological disorder in plants grown in vitro. / Plantas propagadas in vitro são freqüentemente afetadas por condições de estresse que podem levar ao desenvolvimento de hiperidricidade. Nesse sentido, o presente trabalho teve como objetivos investigar a influência de agentes gelificantes, da citocinina 6-benzilaminopurina (BAP) e do tipo de vedação dos frascos sobre a indução de hiperidricidade em videira e morangueiro. Para tal, foram utilizadas plantas de morangueiros Dover e Burkley e do porta-enxerto de videira VR043 43 , mantidas in vitro em sala de crescimento a 25 ± 2 ºC, sob fotoperíodo de 16 h e irradiância 36 mmol m-2 s-1. Explantes de morangueiro foram cultivados em meio contendo sais e vitaminas de MS, 30 g L-1 de sacarose, 100 mg L-1 de inositol, acrescido de Ágar (6,5 g L-1) ou Phytagel® (2,5 g L-1) e BAP em diferentes concentrações (0,5; 1,0; 2,0 e 3,0 mg L-1). Segmentos de entrenós de videira foram transferidos para meio MS meia força ou para meio Q & L, com as mesmas quantidades de sacarose e mioinositol, acrescidos de Ágar (6,5 g L-1) ou Phytagel® (2,5 g L-1) e BAP (1,0 ou 2,0 mg L-1). Foram mensurados os níveis de etileno no interior dos frascos aos 5, 10, 20, e 30 dias de cultivo, para morangueiro, e aos 3, 7, 14, 20, 30 e 40 dias, para videira. Após 35 dias, foram realizadas analisadas bioquímicas (SOD, CAT, POD, isoenzimas, peroxidação de lipídios, teor de clorofila), estruturais (microscopia fotônica e eletrônica de varredura), além da análise das caracteristicas morfológicas da hiperidricidade. Para estudar a influência do tipo de vedação no desenvolvimento de hiperidricidade, plantas de videira e morangueiro foram transferidas para frascos contendo meio indutor e não indutor de hiperidricidade. Os frascos foram vedados com tampa rígida de polipropileno, com e sem membrana permeável a trocas gasosas ou duas camadas de filme pástico de PVC. Foram mensurados os níveis de etileno aos 7, 20 e 40 dias de cultivo e, após 35 dias, foram analisados massas fresca e seca dos brotos, peroxidação de lipídios, sistemas enzimáticos (MDH, ADH e POD), extravasamento de solutos e características ultraestruturais. A adição de BAP no meio de cultivo induziu ao estresse oxidativo que, por sua vez, causou mudanças no estado fisiológico de plantas de morangueiro e videira, caracterizadas por aumento da atividade de enzimas antioxidantes e da peroxidação de lipídios, alterações em nível celular, malformações de estômatos e de células epidérmicas, além de aumento na produção de etileno no interior dos frascos de cultivo. O tipo de vedação utilizado influenciou o ambiente interno dos frascos e, conseqüentemente, o desenvolvimento de hiperidricidade. Nos frascos vedados com membrana permeável, mesmo em meio indutor de hiperidricidade, não foram observadas características morfológicas desse fenômeno, embora tenha sido observado aumento da atividade de peroxidases e de extravasamento de eletrólitos em plantas de videira, submetidas a este tratamento. A vedação de frascos com tampa rígida de polipropileno ou com filme de PVC, em presença de BAP, promoveram maior índice de hiperidricidade, confirmando que o tipo de vedação dos frascos, em combinação com componentes do meio e com condições de cultivo, estão relacionados ao surgimento dessa desordem fisiológica em plantas cultivadas in vitro.

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No entanto, cada genótipo de macieira responde de forma diferente aos estímulos in vitro, de forma que deve-se adequar os protocolos em função da cultivar em estudo. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo traçar os primeiros estudos sobre a utilização de sistema de imersão temporária (SIT) na micropropagação de ‘Marubakaido’. Para tal, testes preliminares sobre a influência do tipo de explante (apical ou axilar) foram realizados via sistema convencional em três variações do meio MS (composição convencional; NH4NO3 e KNO3 reduzido a ¾; e formulação industrial Himedia) suplementados com 0,8 mg.L-1 de BAP, 100 mg.L-1 de mio-inositol, 30 g.L-1 de sacarose e 7 g.L-1 de ágar. Após 45 dias observou-se que o meio Himedia conferiu maior homogeneidade entre as brotações, enquanto o tipo de explante não afetou a resposta quanto ao número e comprimento médio das brotações obtidas, podendo ambos serem utilizados sem prejuízo às taxas de multiplicação. Em seguida, os mesmos meios foram empregados na comparação entre micropropagação de explantes axilares de ‘Marubakaido’ em sistema convencional e SIT. Após 4 semanas verificou-se que as taxas de hiperidricidade obtidas em SIT foram muito mais elevadas do que em sistema convencional, chegando a 100% para meio MS. Uma intensa formação de calos foi observada nos meios MS e MS ¾ neste mesmo sistema, que impediram o desenvolvimento dos explantes. Quanto ao número médio e comprimento de brotações, o meio Himedia em SIT apresentou melhores resultados quando comparado a todos os tratamentos para meio e sistema (6,3 brotações por explante e 3,7 cm). O enraizamento das brotações produzidas em SIT com meio Himedia foi maior quando as brotações foram destacadas se comparadas com brotações mantidas em tufos (74,1% e 62,5% respectivamente), e a aclimatização das microestacas enraizadas resultou em 88,5% de sobrevivência após 21 dias. Embora os resultados tenham sido promissores, novos estudos ainda precisam ser realizados na tentativa de aperfeiçoar estes protocolos para ‘Marubakaido’, como alterações na composição hormonal, tempo e frequência de passagem do meio para os explantes ou enraizamento ao abrigo de luz. / The apple tree is a woody fruit widespread in the world. Your plants are propagated by cuttings and rootstocks by layering strain due to the high level of incompatibility between the genotypes and great period of juvenility. Rootstocks confer differences in vigor and disease resistance to scion, being more used in Brazil the cultivars M.9 (dwarf) and 'Marubakaido' (vigorous). Due to phytosanitary problems and yield of vegetative propagation technique, micropropagation appears as a useful technology at level of research or commercially. However, each apple genotype responds differently to in vitro stimuli, so the protocols must be adapted according to cultivar in study. Herewith, the present research aimed to draw the first studies about the use of temporary immersion system (TIS) in ‘Marubakaido's micropropagation. For this purpose, preliminary tests about the influence of the type of explant (apical or axillary) were performed via conventional system in three variations of the MS media (conventional composition; NH4NO3 and KNO3 reduced to ¾, and industrial formulation Himedia) supplemented with 0.8 mg.L-1 BAP, 100 mg L-1 myo-inositol, 30 g L-1 sucrose and 7 g L-1 agar. After 45 days it was observed that the Himedia conferred greater homogeneity among the shoots, while the type of explant did not affect the response in the average of number and length of shoots obtained, and both can be used without prejudice to the multiplication rates. Then, the same media were used in the comparison of micropropagation of ‘Marubakaido’ axillary explants between conventional system and TIS. After 4 weeks it was found that the hyperhydricity rates obtained with TIS were much higher than in conventional system, reaching 100% at MS medium. An intense callus formation was observed in MS and MS ¾ media at same system, which stopped the development of the explants. For the mean of number and length shoots, the Himedia composition in TIS showed better results when compared to all treatments for media and system (6.3 shoots per explant and 3.7 cm). Rooting of shoots produced in TIS with Himedia was higher when the shoots were separated compared with shoots kept in tufts (74.1% and 62.5% respectively), and acclimatization of the rooted microcutting resulted in 88.5% of survival after 21 days. Although the results have been promising, further studies still need to be performed to improve these protocols to ‘Marubakaido’, as changes in hormonal composition, time and frequency for passage of media to the explants or rooting under darkness.