Foi demonstrado que a L-prolina é fundamental para o metabolismo das formas intracelulares de T.cruzi e está envolvida em processos de resistência a diferentes condições de estresse. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C) age como inibidor competitivo do transporte de prolina para o interior do parasita, desta forma, pode-se assumir que, quando aplicado como agente terapêutico simula uma situação de hipoprolinemia no hospedeiro mamífero. Sobre esta base, propomos que a prolinemia poderia estar relacionada com a severidade da infecção pelo T. cruzi, portanto, decidimos inverter o racional e obter nesse trabalho um modelo de hiperprolinemia. Inicialmente foi estabelecido um modelo murino de hiperprolinemia transiente. Camundongos da linhagem BALB/c que foram tratados com prolina, por via intraperitonial (i.p), em 30 minutos já apresentaram concentrações plasmáticas de 1,359 ± 0,121 mM, porém, após 3 horas seus níveis plasmáticos retornaram ao normal, 0,4361 ± 0,03496. Utilizando este modelo, foi avaliado o efeito da hiperprolinemia transiente em camundongos infectados pelo T.cruzi. Em três ensaios de um total de seis foi observado um aumento significativo da parasitemia em camundongos tratados, sem nenhuma diferença na mortalidade e na carga parasitária de diversos tecidos. Essa inconsistência observada no perfil da parasitemia redirecionou os experimentos para um modelo de hiperprolinemia hereditário previamente estabelecido. Interessantemente, foram observados diminuições na parasitemia, porém, a mortalidade foi aumentada. Foi hipotetizado que, diferentemente do que acontece com a hiperprolinemia transiente, com os níveis plasmáticos aumentados de maneira estável, as formas intracelulares de T.cruzi teriam acesso ao aminoácido em quantidades e tempo maiores. No entanto, não se pode descartar como hipótese complementar, que a hiperprolinemia possa afetar a resposta imune e por sua vez, imunossuprimir ou imunoestimular o hospedeiro mamífero. Por esse motivo, avaliaram-se alguns parâmetros da resposta imune ex vivo. Ensaios ex vivo mostraram que tratamento com prolina diminui a produção de NO sob ativação por LPS, no entanto quando células peritoneais não ativadas por LPS são infectadas por T. cruzi, o tratamento com prolina não altera o perfil de NO. A expressão gênica da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) das células peritoneais diminui quando elas são cultivadas na presença de prolina, confirmando esses resultados. Mostrou-se dessa maneira que a hiperprolinemia pode interferir com a resposta imune do hospedeiro, o que levaria a uma eventual imunossupressão. Observou-se que, tanto células peritoneais infectadas como não infectados tratadas com prolina apresentam redução de seu volume celular o que poderia ser indício de sinal apoptótico. Ensaios de infecção (ex vivo) em células peritoneais de camundongos BALB/c com tripomastigotas da cepa MJL superexpressando o transportador de prolina apresentaram aumento da taxa de infecção enquanto que as infectadas por tripomastigotas da cepa Y superexpressando o mesmo transportador de prolina apresentaram diminuição da taxa de infeçção, quando comparadas aos controles, mostrando que a reposta de redução ou aumento da taxa de infecção ao tratamento com prolina é determinada também pela cepa de T. cruzi. Análises da prolinemia em soro de pacientes com sintomas de cardiopatia chagásica severa mostraram menores níveis de prolina sérica quando comparados aos controles (pacientes não infectados). Juntos, todos esses resultados colocam a prolina como um fator de severidade na infecção pelo T. cruzi. / It was shown that L-proline is essential for the metabolism of the intracellular forms of T. cruzi and is involved in resistance to different stress conditions. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C) acts as a competitive inhibitor of the proline transport to the inside of parasite, thus it can be assumed that when T4C is applied as a therapeutic agent simulates a hipoprolinemia situation in the mammalian host. On this basis, we propose that prolinemia could be related to the severity of T. cruzi infection, then, in this work we decided to reverse the rational and obtain a hyperprolinemia model. As a starting point, it was established a mouse transient hyperprolinemia model. BALB/c mice were intraperitoneally injected with proline showed an increased proline levels in sera after 30 min (1,359 ± 0,121 mM). However, these increased levels were diminished to normal levels after 3 h (0,4361 ± 0,03496 mM). Once established this model, was initially used to evaluate the effect of transient hyperprolinemia in mice infected by T.cruzi. In three out of six experiments an increase in parasitemia but not in mortality or in tissue parasite loads was observed. In the remaining three experiments no differences were detected. These inconsistencies directed the work to the search to a previously established hereditary model of mouse hyperprolinemia model. Interestingly, in this new model, a diminished parasitemia was recorded, however, mortality was higher. From this information it was hypothesized that, differently to what happens in the transient hyperprolinemia, a permanent hyperprolinemia exposes the T. cruzi infected cells (and so, the intracellular parasites) to higher concentrations of proline as well as for longer times. In addition, it cannot be disregarded the complementary hypothesis that hyperprolinemia could be affecting the immune response and, at the same time of its action on the parasite, it could be immunosupresing or immunostimulating the mammalian host. This possibility led us to evaluate some parameters of the immune response both, in vivo and ex vivo. Ex vivo assays showed that proline-treated LPS-activated peritoneal cells had a diminished production of NO while proline-treatment of T. cruzi infected, non-LPS-activated peritoneal cells did not affect their NO production. This data showed that hyperprolinemia could interfer the immune response leading the host to an eventual immunosupresion. In addition, both, infected and non-infected macrophages had their cellular volume diminished when treated with proline, which could be attributed to the iniciation of an apoptotic process. Infection assays (ex vivo) of perioneal cells from BALB/c mice with MJL strain trypomastigotes overexpressing a proline transporter had an increased infection rate, while the same type of cells infected with Y strain trypomastigotes overexpressing the same proline transporter showed a diminution in the infection rate. These results show that changes in the infection rate as a function of intracellular proline availability depends on T. cruzi strain. The analysis of prolinemia in patients serum with symptoms of Severe Chronic Chagasic Cardiopathy showed tat proline levels were diminished in comparison to control (non-infected patients). Taken together, these results prompt proline as a factor modulating the severity of T. cruzi infection.

Foi demonstrado que a L-prolina é fundamental para o metabolismo das formas intracelulares de T.cruzi e está envolvida em processos de resistência a diferentes condições de estresse. O ácido L-tiazolidina-4-carboxílico (T4C) age como inibidor competitivo do transporte de prolina para o interior do parasita, desta forma, pode-se assumir que, quando aplicado como agente terapêutico simula uma situação de hipoprolinemia no hospedeiro mamífero. Sobre esta base, propomos que a prolinemia poderia estar relacionada com a severidade da infecção pelo T. cruzi, portanto, decidimos inverter o racional e obter nesse trabalho um modelo de hiperprolinemia. Inicialmente foi estabelecido um modelo murino de hiperprolinemia transiente. Camundongos da linhagem BALB/c que foram tratados com prolina, por via intraperitonial (i.p), em 30 minutos já apresentaram concentrações plasmáticas de 1,359 ± 0,121 mM, porém, após 3 horas seus níveis plasmáticos retornaram ao normal, 0,4361 ± 0,03496. Utilizando este modelo, foi avaliado o efeito da hiperprolinemia transiente em camundongos infectados pelo T.cruzi. Em três ensaios de um total de seis foi observado um aumento significativo da parasitemia em camundongos tratados, sem nenhuma diferença na mortalidade e na carga parasitária de diversos tecidos. Essa inconsistência observada no perfil da parasitemia redirecionou os experimentos para um modelo de hiperprolinemia hereditário previamente estabelecido. Interessantemente, foram observados diminuições na parasitemia, porém, a mortalidade foi aumentada. Foi hipotetizado que, diferentemente do que acontece com a hiperprolinemia transiente, com os níveis plasmáticos aumentados de maneira estável, as formas intracelulares de T.cruzi teriam acesso ao aminoácido em quantidades e tempo maiores. No entanto, não se pode descartar como hipótese complementar, que a hiperprolinemia possa afetar a resposta imune e por sua vez, imunossuprimir ou imunoestimular o hospedeiro mamífero. Por esse motivo, avaliaram-se alguns parâmetros da resposta imune ex vivo. Ensaios ex vivo mostraram que tratamento com prolina diminui a produção de NO sob ativação por LPS, no entanto quando células peritoneais não ativadas por LPS são infectadas por T. cruzi, o tratamento com prolina não altera o perfil de NO. A expressão gênica da óxido nítrico sintase induzível (iNOS) das células peritoneais diminui quando elas são cultivadas na presença de prolina, confirmando esses resultados. Mostrou-se dessa maneira que a hiperprolinemia pode interferir com a resposta imune do hospedeiro, o que levaria a uma eventual imunossupressão. Observou-se que, tanto células peritoneais infectadas como não infectados tratadas com prolina apresentam redução de seu volume celular o que poderia ser indício de sinal apoptótico. Ensaios de infecção (ex vivo) em células peritoneais de camundongos BALB/c com tripomastigotas da cepa MJL superexpressando o transportador de prolina apresentaram aumento da taxa de infecção enquanto que as infectadas por tripomastigotas da cepa Y superexpressando o mesmo transportador de prolina apresentaram diminuição da taxa de infeçção, quando comparadas aos controles, mostrando que a reposta de redução ou aumento da taxa de infecção ao tratamento com prolina é determinada também pela cepa de T. cruzi. Análises da prolinemia em soro de pacientes com sintomas de cardiopatia chagásica severa mostraram menores níveis de prolina sérica quando comparados aos controles (pacientes não infectados). Juntos, todos esses resultados colocam a prolina como um fator de severidade na infecção pelo T. cruzi. / It was shown that L-proline is essential for the metabolism of the intracellular forms of T. cruzi and is involved in resistance to different stress conditions. L-thiazolidine-4-carboxylic acid (T4C) acts as a competitive inhibitor of the proline transport to the inside of parasite, thus it can be assumed that when T4C is applied as a therapeutic agent simulates a hipoprolinemia situation in the mammalian host. On this basis, we propose that prolinemia could be related to the severity of T. cruzi infection, then, in this work we decided to reverse the rational and obtain a hyperprolinemia model. As a starting point, it was established a mouse transient hyperprolinemia model. BALB/c mice were intraperitoneally injected with proline showed an increased proline levels in sera after 30 min (1,359 ± 0,121 mM). However, these increased levels were diminished to normal levels after 3 h (0,4361 ± 0,03496 mM). Once established this model, was initially used to evaluate the effect of transient hyperprolinemia in mice infected by T.cruzi. In three out of six experiments an increase in parasitemia but not in mortality or in tissue parasite loads was observed. In the remaining three experiments no differences were detected. These inconsistencies directed the work to the search to a previously established hereditary model of mouse hyperprolinemia model. Interestingly, in this new model, a diminished parasitemia was recorded, however, mortality was higher. From this information it was hypothesized that, differently to what happens in the transient hyperprolinemia, a permanent hyperprolinemia exposes the T. cruzi infected cells (and so, the intracellular parasites) to higher concentrations of proline as well as for longer times. In addition, it cannot be disregarded the complementary hypothesis that hyperprolinemia could be affecting the immune response and, at the same time of its action on the parasite, it could be immunosupresing or immunostimulating the mammalian host. This possibility led us to evaluate some parameters of the immune response both, in vivo and ex vivo. Ex vivo assays showed that proline-treated LPS-activated peritoneal cells had a diminished production of NO while proline-treatment of T. cruzi infected, non-LPS-activated peritoneal cells did not affect their NO production. This data showed that hyperprolinemia could interfer the immune response leading the host to an eventual immunosupresion. In addition, both, infected and non-infected macrophages had their cellular volume diminished when treated with proline, which could be attributed to the iniciation of an apoptotic process. Infection assays (ex vivo) of perioneal cells from BALB/c mice with MJL strain trypomastigotes overexpressing a proline transporter had an increased infection rate, while the same type of cells infected with Y strain trypomastigotes overexpressing the same proline transporter showed a diminution in the infection rate. These results show that changes in the infection rate as a function of intracellular proline availability depends on T. cruzi strain. The analysis of prolinemia in patients serum with symptoms of Severe Chronic Chagasic Cardiopathy showed tat proline levels were diminished in comparison to control (non-infected patients). Taken together, these results prompt proline as a factor modulating the severity of T. cruzi infection.

Neste trabalho foi investigado o efeito da administração crônica de prolina sobre o conteúdo total de gangliosídios, fosfolipídios e de colesterol, assim como, sobre o perfil de gangliosídios no córtex, no hipocampo, no hipotálamo e no cerebelo de ratos. Também, foi avaliado o conteúdo e o perfil de gangliosídios nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos: 1) injetados subcutaneamente com solução 0,9% de NaCl (animais controle) e 2) injetados subcutaneamente com solução de prolina, em concentrações adequadas ao peso corporal (animais hiperprolinêmicos). Tanto a solução de prolina quanto a salina foram administradas do 6° ao 28° dia pós-natal. Doze horas após a última administração, os animais foram sacrificados mediante decapitação sem anestesia. As estruturas cerebrais foram dissecadas e em seguida homogeneizadas em clorofórmio:metanol na proporção 1:1 vpara a extração lipídica. As membranas sinápticas foram obtidas através de centrifugação diferencial e as frações solúvel e resistente a detergente foram isoladas através de tratamento das membranas com Triton X-100 a 4°C para investigação de microdomínios de membrana. Após a realização das análises, os resultados mostraram que os animais submetidos ao tratamento crônico com prolina apresentaram um marcado aumento no conteúdo de gangliosídios no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto os conteúdos de fosfolipídios e de colesterol aumentaram somente no hipocampo. Além disso, os conteúdos destes compostos não foram alterados no hipotálamo e no cerebelo de animais hiperprolinêmicos. Por outro lado, o conteúdo de gangliosídios diminuiu nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex de animais hiperprolinêmicos. Embora os perfis de gangliosídios não tenham sido aparentemente modificados, as quantidades absolutas das espécies foram alteradas tanto no extrato total, como nos microdomínios de membrana obtidos do córtex. Estes dados revelam que o tratamento crônico com prolina afeta de forma distinta as diferentes regiões cerebrais quanto à composição lipídica das membranas celulares, refletindo-se sobre a distribuição de lipídios nos microdomínios de membrana do córtex. Entre as conseqüências destes fenômenos poderiam ser sugeridas modulações diferentes nas transmissões sinápticas que contribuiriam para o déficit cognitivo e/ou outras disfunções neurológicas presentes em pacientes com hiperprolinemia tipo II. / In the present work we investigated the effects of chronic proline administration on ganglioside, cholesterol and phospholipid total contents, as well as on ganglioside profile in cerebral cortex, hippocampus, hypothalamus and cerebellum of rats. We also evaluated the ganglioside content and profile in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membranes obtained from cerebral cortex. Wistar rats were divided into two groups: 1) saline (control) and 2) proline injected (hyperprolinemic). Proline solution or saline were administered from 6th to 28th postnatal day, according to body weight. Twelve hours after the last injection, the animals were sacrificed by decapitation without anesthesia. Brain structures were homogenized with chlorophorm:methanol 1:1 for lipid extraction. Synaptic membrane was extracted by differential centrifugation and detergent- soluble and resistant fractions were isolated by cold Triton X-100 treatment. Results showed that rats subjected to chronic proline treatment presented a significant increase of ganglioside content on cortex and hippocampus, while phospholipid and cholesterol contents only increased in hippocampus. However, the content of these components were not altered in hypothalamus and cerebellum of hyperprolinemic rats. On the other hand, ganglioside content decreased in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membrane obtained from hyperprolinemic cortex. Although ganglioside profiles were apparently not modified, the individual absolute quantities were altered in cortex total lipid extract and membrane microdomains obtained from cerebral cortex. Our findings suggest that chronic proline treatment affects, in a distinct manner, different cerebral regions concerning the lipid composition of the cell membranes, reflecting on its distribution in the cortex membrane microdomains. Among these phenomena consequences, different modulations in synaptic transmission may be suggested which may contribute to the impairment in cognition and/or other neurological disfunctions found in hyperprolinemia type II patients.

Neste trabalho foi investigado o efeito da administração crônica de prolina sobre o conteúdo total de gangliosídios, fosfolipídios e de colesterol, assim como, sobre o perfil de gangliosídios no córtex, no hipocampo, no hipotálamo e no cerebelo de ratos. Também, foi avaliado o conteúdo e o perfil de gangliosídios nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos: 1) injetados subcutaneamente com solução 0,9% de NaCl (animais controle) e 2) injetados subcutaneamente com solução de prolina, em concentrações adequadas ao peso corporal (animais hiperprolinêmicos). Tanto a solução de prolina quanto a salina foram administradas do 6° ao 28° dia pós-natal. Doze horas após a última administração, os animais foram sacrificados mediante decapitação sem anestesia. As estruturas cerebrais foram dissecadas e em seguida homogeneizadas em clorofórmio:metanol na proporção 1:1 vpara a extração lipídica. As membranas sinápticas foram obtidas através de centrifugação diferencial e as frações solúvel e resistente a detergente foram isoladas através de tratamento das membranas com Triton X-100 a 4°C para investigação de microdomínios de membrana. Após a realização das análises, os resultados mostraram que os animais submetidos ao tratamento crônico com prolina apresentaram um marcado aumento no conteúdo de gangliosídios no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto os conteúdos de fosfolipídios e de colesterol aumentaram somente no hipocampo. Além disso, os conteúdos destes compostos não foram alterados no hipotálamo e no cerebelo de animais hiperprolinêmicos. Por outro lado, o conteúdo de gangliosídios diminuiu nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex de animais hiperprolinêmicos. Embora os perfis de gangliosídios não tenham sido aparentemente modificados, as quantidades absolutas das espécies foram alteradas tanto no extrato total, como nos microdomínios de membrana obtidos do córtex. Estes dados revelam que o tratamento crônico com prolina afeta de forma distinta as diferentes regiões cerebrais quanto à composição lipídica das membranas celulares, refletindo-se sobre a distribuição de lipídios nos microdomínios de membrana do córtex. Entre as conseqüências destes fenômenos poderiam ser sugeridas modulações diferentes nas transmissões sinápticas que contribuiriam para o déficit cognitivo e/ou outras disfunções neurológicas presentes em pacientes com hiperprolinemia tipo II. / In the present work we investigated the effects of chronic proline administration on ganglioside, cholesterol and phospholipid total contents, as well as on ganglioside profile in cerebral cortex, hippocampus, hypothalamus and cerebellum of rats. We also evaluated the ganglioside content and profile in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membranes obtained from cerebral cortex. Wistar rats were divided into two groups: 1) saline (control) and 2) proline injected (hyperprolinemic). Proline solution or saline were administered from 6th to 28th postnatal day, according to body weight. Twelve hours after the last injection, the animals were sacrificed by decapitation without anesthesia. Brain structures were homogenized with chlorophorm:methanol 1:1 for lipid extraction. Synaptic membrane was extracted by differential centrifugation and detergent- soluble and resistant fractions were isolated by cold Triton X-100 treatment. Results showed that rats subjected to chronic proline treatment presented a significant increase of ganglioside content on cortex and hippocampus, while phospholipid and cholesterol contents only increased in hippocampus. However, the content of these components were not altered in hypothalamus and cerebellum of hyperprolinemic rats. On the other hand, ganglioside content decreased in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membrane obtained from hyperprolinemic cortex. Although ganglioside profiles were apparently not modified, the individual absolute quantities were altered in cortex total lipid extract and membrane microdomains obtained from cerebral cortex. Our findings suggest that chronic proline treatment affects, in a distinct manner, different cerebral regions concerning the lipid composition of the cell membranes, reflecting on its distribution in the cortex membrane microdomains. Among these phenomena consequences, different modulations in synaptic transmission may be suggested which may contribute to the impairment in cognition and/or other neurological disfunctions found in hyperprolinemia type II patients.

Neste trabalho foi investigado o efeito da administração crônica de prolina sobre o conteúdo total de gangliosídios, fosfolipídios e de colesterol, assim como, sobre o perfil de gangliosídios no córtex, no hipocampo, no hipotálamo e no cerebelo de ratos. Também, foi avaliado o conteúdo e o perfil de gangliosídios nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex. Ratos Wistar foram divididos em dois grupos: 1) injetados subcutaneamente com solução 0,9% de NaCl (animais controle) e 2) injetados subcutaneamente com solução de prolina, em concentrações adequadas ao peso corporal (animais hiperprolinêmicos). Tanto a solução de prolina quanto a salina foram administradas do 6° ao 28° dia pós-natal. Doze horas após a última administração, os animais foram sacrificados mediante decapitação sem anestesia. As estruturas cerebrais foram dissecadas e em seguida homogeneizadas em clorofórmio:metanol na proporção 1:1 vpara a extração lipídica. As membranas sinápticas foram obtidas através de centrifugação diferencial e as frações solúvel e resistente a detergente foram isoladas através de tratamento das membranas com Triton X-100 a 4°C para investigação de microdomínios de membrana. Após a realização das análises, os resultados mostraram que os animais submetidos ao tratamento crônico com prolina apresentaram um marcado aumento no conteúdo de gangliosídios no córtex cerebral e no hipocampo, enquanto os conteúdos de fosfolipídios e de colesterol aumentaram somente no hipocampo. Além disso, os conteúdos destes compostos não foram alterados no hipotálamo e no cerebelo de animais hiperprolinêmicos. Por outro lado, o conteúdo de gangliosídios diminuiu nas frações solúvel e resistente a detergente obtidas de membranas sinápticas de córtex de animais hiperprolinêmicos. Embora os perfis de gangliosídios não tenham sido aparentemente modificados, as quantidades absolutas das espécies foram alteradas tanto no extrato total, como nos microdomínios de membrana obtidos do córtex. Estes dados revelam que o tratamento crônico com prolina afeta de forma distinta as diferentes regiões cerebrais quanto à composição lipídica das membranas celulares, refletindo-se sobre a distribuição de lipídios nos microdomínios de membrana do córtex. Entre as conseqüências destes fenômenos poderiam ser sugeridas modulações diferentes nas transmissões sinápticas que contribuiriam para o déficit cognitivo e/ou outras disfunções neurológicas presentes em pacientes com hiperprolinemia tipo II. / In the present work we investigated the effects of chronic proline administration on ganglioside, cholesterol and phospholipid total contents, as well as on ganglioside profile in cerebral cortex, hippocampus, hypothalamus and cerebellum of rats. We also evaluated the ganglioside content and profile in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membranes obtained from cerebral cortex. Wistar rats were divided into two groups: 1) saline (control) and 2) proline injected (hyperprolinemic). Proline solution or saline were administered from 6th to 28th postnatal day, according to body weight. Twelve hours after the last injection, the animals were sacrificed by decapitation without anesthesia. Brain structures were homogenized with chlorophorm:methanol 1:1 for lipid extraction. Synaptic membrane was extracted by differential centrifugation and detergent- soluble and resistant fractions were isolated by cold Triton X-100 treatment. Results showed that rats subjected to chronic proline treatment presented a significant increase of ganglioside content on cortex and hippocampus, while phospholipid and cholesterol contents only increased in hippocampus. However, the content of these components were not altered in hypothalamus and cerebellum of hyperprolinemic rats. On the other hand, ganglioside content decreased in detergent- soluble and resistant fractions isolated from synaptic membrane obtained from hyperprolinemic cortex. Although ganglioside profiles were apparently not modified, the individual absolute quantities were altered in cortex total lipid extract and membrane microdomains obtained from cerebral cortex. Our findings suggest that chronic proline treatment affects, in a distinct manner, different cerebral regions concerning the lipid composition of the cell membranes, reflecting on its distribution in the cortex membrane microdomains. Among these phenomena consequences, different modulations in synaptic transmission may be suggested which may contribute to the impairment in cognition and/or other neurological disfunctions found in hyperprolinemia type II patients.