Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La production hépatique de glucose dérive du glucose-6-phosphate (G6P) produit par la glycogénolyse et la néoglucogénèse et son hydrolyse subséquente par la glucose-6-phosphatase (G6Pase). C'est pourquoi la G6Pase joue un rôle crucial dans le maintien de la glycémie. La G6Pase est un système enzymatique à plusieurs composantes, situé dans le réticulum endoplasmique (RE) et est exprimé dans les deux organes néoglucogéniques, foie et rein, ainsi que dans l'intestin. Jusqu'à maintenant, deux composantes du système ont été clonées, l'unité catalytique qui est une protéine de 36 kDa (p36) et un transporteur putatif de G6P de masse moléculaire de 46 kDa (p46). Depuis le clonage du gène et de l' ADNc de p36, la régulation de l'expression de p36 a été étudiée en détail. Des effecteurs positifs qui augmentent l' ARNm de p36 comprennent le glucose, l' AMP cyclique, les glucocorticoïdes et les acides gras, tandis que l'insuline diminue l'abondance de l' ARNm de p36. Le glucose, l' AMP cyclique et les glucocorticoïdes ont également un effet positif sur l' ARN m de p46, tandis que l'insuline contrecarre ces effets. Deux modèles ont été proposés pour expliquer le mécanisme fonctionnel du système G6Pase : le modèle de transport du substrat et le modèle conformationnel. Le premier propose que la G6Pase est un système à plusieurs composantes, comprenant une unité catalytique dont le site actif est orienté vers la lumière du RE, un transporteur de G6P appelé Tl, un transporteur de phosphate inorganique (Pi) appelé T2 et un transporteur de glucose appelé T3. Tl serait l'étape limitante de la conversion de G6P en glucose et Pi. Il a été proposé que des mutations dans les gènes de ces quatres composantes causent des glycogènoses de type la, lb, le, and Id, respectivement. Le modèle conformationnel propose que la G6Pase est une protéine formant un canal dans la membrane du RE, où le site actif est enfoui dans une poche hydrophile. Le substrat a accès au site actif via le canal. Le processus hydrolytique a lieu dans la poche hydrophile et les produits sont délivrés dans la lumière et exportés dans le cytoplasme par l'intermédiaire du canal. Les cinétiques rapides d'hydrolyse du G6P indiquent une transition hystérétique dans le processus catalytique qui réduit la vitesse de la réaction au profit d'une spécifité accrue pour le G6P. Le phosphate inorganique (Pi) est une composante fondamentale de l'organisme par son implication dans de nombreuses fonctions physiologiques. L'homéostasie du Pi est règlée au niveau du rein par sa réabsorption par un co-transporteur de sodium et de phosphate (NaPi), essentiellement }'isoforme NaPi-2. Le contenu en Pi dans la diète, qui est important pour le maintien de la phosphatémie normale; affecte l'expression de la NaPi-2, de l'hormone parathyroïdienne, du Pi et du calcium sérique. L'hypophosphatémie liée au chromosome X est causée par une mutation dans le gène PHEX (pour : Phosphate-regulating gene with Homologies to Endopeptidase located on the X chromosome). Des travaux établissant que des perturbations dans l'homéostasie du phosphate pouvaient causer une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline suggèrent une association entre l'homéostasie du glucose et du phosphate. La nature même de cette association est néanmoins encore inconnue. Nous avons donc investigué le métabolisme du glucose hépatique lors d'une diète déficiente en phosphate ainsi que chez un modèle animal d'hypophosphatémie liée au chromosome X, la souris Hyp. Les résultats montrent que le phosphate plasmatique était diminué chez des rats nourris pendant 48h avec une diète déficiente en Pi (-Pi) comparés à une diète contrôle (+Pi). Dans le groupe (-Pi), l'activité de la G6Pase hépatique était augmentée lorsque mesurée dans des microsomes intacts ou perméabilisés au moyen de détergent, à des concentrations de substrat physiologiques ou saturantes. Cette activité accrue était due à une stimulation de l'expression de l'unité catalytique, comme en témoigne l'augmentation de l'abondance de l' ARN m et de l'immunoréactivité de p36. L' ARNm de p46 était également augmentée dans le groupe (-Pi), mais sans changement dans la quantité de protéine. Nos études subséquentes montrèrent que dans le foie des animaux du groupe (-Pi), la pyruvate kinase était inactivée et le phosphoenolpyruvate augmenté, et que le fiuctose-2,6- bisphosphate, un inhibiteur de la néoglucogénèse, était réduit de moitié. L'activité de la glucokinase n'était pas modifiée et celle de la phosphoenolpyruvate kinase était marginalement augmentée par la diète (-Pi), L'ensemble de ces résultats peuvent s'expliquer par l'augmentation de la concentration de l' AMP cyclique observée dans le foie des rats nourris avec la diète (-Pï). Ces résultats suggèrent que la néoglucogénèse hépatique pourrait être stimulée dans des conditions d'hypophosphatémie et qu'une production accrue de glucose pourrait contribuer à une altération du métabolisme du glucose. Cette possibilité est renforcée par l'observation que la glycémie des rats nourris avec la diète (-Pi) était nettement augmentée, tandis que la concentration de l'insuline plasmatique était diminuée. Un test de tolérance intravéneuse au glucose n'a pas permis d'observer de différence au niveau de la normalisation de la glycémie, mais a cependant indiqué une légère intolérance au glucose dans la mesure ou le pic de glucose atteint après le test était plus élevé dans le groupe (-Pi). Par ailleurs, la production endogène de glucose était nettement moins inhibée après un bolus de glucose au cours du test de tolérance intravéneuse au glucose. Afin d'élucider d'avantage la relation entre homéostasie du glucose et du :?i, le système G6Pase de foie et de rein furent examinés chez la souris Hyp. Les résultats montrent que l'activité de la G6Pase était augmentée dans ces organes des souris Hyp, semblablement à l'augmentation observée chez les rats nourris avec la diète (­Pi). Cette activité accrue de la G6Pase chez la souris Hyp s'explique par une plus grande quantité d' ARNm et de protéine p36, aussi bien dans le foie que dans le rein. Contrairement au modèle diététique d'hypophosphatémie, chez la souris Hyp l'abondance de l' ARNm et l'immunoréactivité du p46 hépatique et rénal sont nettement diminués. Globalement, l'hypophosphatémie résultant soit d'une carence alimentaire ou due à un défaut génétique a pour effet d'augmenter de façon consistante l'activité de la G6Pase, elle-même causée par une stimulation de l'expression de son unité catalytique, p36. L'expression de p46 est différemment règlée par la diète déficiente en Pi ou dans le modèle génétique, indicant que d'autres facteurs que l'hypophosphatémie affectent ce gène dans ces conditions. Il apparaît que la régulation de l'expression de p3 6 et de p46 est distincte. Bien que le système G6Pase a été étudié depuis vo1c1 cinquante ans, son organisation et son mécanisme fonctionnel restent à être définis. Les propriétés cinétiques de transport du substrat, le G6P, et des produits, le glucose et le Pï, ne sont pas encore élucidés. Ces propriétés ont été investiguées au moyen d'un appareil à collection et filtration rapide (FSRF A). Le transport microsomal du Pi montre des valeurs identiques de T v. à différentes concentrations de KH2P04. Le HgCh et des inhibiteurs potentiels de la G6Pase n'affectent pas les propriétés cinétiques du transport de Pi. On n'a également pas trouvé d'échange accéléré de Pi ou de saturation du transport de celui-ci. Ces résultats ne sont pas compatibles avec l'existence d'un transporteur spécifique pour le Pi dans la membrane du RE. Des conclusions similaires ont été tirées d'études du transport microsomal du glucose. L'accumulation intramicrosomale de radioactivité à partir de [U-14C]G6P ou de [32P]G6P correspond à des paramètres cinétiques différents, indicant que les substances accumulées dans les microsomes à partir de G6P sont les produits de la réaction de la G6Pase plutôt que le substrat. Cette observation suggère que l'étape de transport du G6P, si tant est qu'elle existe, n'est pas l'étape limitante au cours de la conversion du G6P en glucose et Pï, Les paramètres cinétiques d'accumulation de radioactivité à partir de [32P]G6P et les effets des inhibiteurs de la G6Pase démontrent que cette accumulation est étroitement couplée à l'activité hydrolytique de la G6Pase. De plus, nous n'avons pas observé d'échange de transport entre le G6P et le Pi ou le glucose, en accord avec l'absence présumée de transporteur spécifique pour le Pi ou le glucose. Globalement, ces données sont compatibles avec le modèle conformationnel de la G6Pase. Une nouvelle version de ce modèle, intégrant les résultats concernant le transport de Pï et de glucose, propose qu'un pore dans la membrane du RE puisse remplir la fonction d'influx/efllux des produits de la G6Pase. / Glucose-6-phosphatase (G6Pase), a multicomponent enzyme, plays a crucial role in glucose metabolism by hydrolyzing glucose-6-phosphate (G6P) into glucose and inorganic phosphate (Pi). G6Pase is located in the endoplasmic reticulum membrane and highly expressed in liver and kidneys. Two components of G6Pase have been cloned, the catalytic subunit (p36) and the putative G6P translocase (p46). Despite the great progress in G6Pase field, the hydrolytic mechanism of G6Pase is still in debate. Meanwhile, evidence also indicates that Pi deficiency is related to impaired glucose metabolism with an unclear mechanism. In this thesis, the effects of Pi deficiency on G6Pase and other glucoregulatory factors were investigated. Meanwhile, the hydrolytic mechanism of G6Pase was also studied in terms of its transport properties. Results showed that compared to the rats fed with a control diet ( +Pi), in the rats fed with a phosphate deficient diet (-Pi) for 48h, plasma phosphate concentration was decreased. Liver G6Pase was upregulated, gluconeogenesis key steps ;vere stimulated, liver glycogen content was decreased and plasma glucose concentration was increased in the fed (-Pi) group. These changes could be accounted for by increased liver cAMP content and decreased plasma insulin concentration in the fed (-Pi) group. During an intravenous glucose tolerance test, although similar glucose fall rates and insulin responses were observed in overnight fasted (+Pi) and (-Pi) group, a tendency to hyperglycemia and less suppressed endogenous glucose production were obtained in the (-Pi) group. Ali of these results demonstrated that under the phosphate deficient condition, G6Pase was upregulated and glucose production was enhanced. The enhanced glucose production, potentially caused by the altered insulin/glucagon ratio, may contribute to the impaired glucose metabolism. To further elucidate the relationship between glucose homeostasis and phosphate homeostasis, liver and kidney G6Pase system were investigated in X-linked hypophosphatemic mice, Hyp mice. Results showed G6Pase activity was increased in Hyp mouse liver and kidney. Consistently, the protein amount and mRNA abundance of the catalytic subunit, p36, were increased in Hyp mouse liver and kidney. In contrast, the mRNA abundance and protein amount of p46 were decreased in Hyp mouse liver and kidney. These results further dernonstrated that G6Pase activity was stimulated by Pi deficiency. The increased G6pase activity may enhance glucose production, probably contributing to impaired glucose metabolisrn. The hydrolytic mechanism of G6Pase was investigated via transport studies. Inorganic phosphate (KH2P04) transport across rnicrosornes showed identical T 112 values around 23 s at different KH2P04 concentrations, which were unaffected by potential inhibitors of G6Pase. Neither accelerated exchanging transport nor saturable effect was observed in this process. These results supported no specific inorganic phosphate transporter in the ER membrane. Similar phenomena were observed for the glucose transport process, which was characterized with T 112 values of 40 s. Tracer equilibration during [U-14C]- and [32P]G6P hydrolysis proceeded with T 112 values of 4 7 and 21 s, respectively. Steady state levels of tracer accumulation from [U-14C]­and [32P]G6P were also different frorn each other and had a similar ratio to that of their T 112 values. This result dernonstrated that the accumulated radiotracer was the product, Pi or glucose, rather than the substrate G6P. Effects of unlabelled G6P and inhibitors on [32P]G6P uptake dernonstrated that G6P uptake and hydrolysis were tightly coupled processes. Moreover, no exchanging transport between G6P and inorganic phosphate/glucose was observed. These results are not compatible with the substrate-transport rnodel of G6Pase. Based on these data, a new combined­conformational model is proposed to explain the G6Pase system. In this model, G6P transport/hydrolysis are tightly coupled processes whereas glucose and phosphate share with water and a variety of other organic and inorganic solutes a common pore­like structure accounting for their transport through the ER membrane. The p46 protein rnay be more like a G6P sensor than a G6P transporter. The binding of G6P to p46 may affect the conformation of p46 and p36 via their coupling interaction. The conformational change rnay account for the specificity and latency of G6Pase.

Introduction : L’hypophosphatémie survient couramment après hépatectomie partielle. La régénération du foie était l’explication initiale. Cependant, les pertes rénales de phosphate observées récemment suggèrent que l’hypophosphatémie est probablement d’origine rénale. Nous avons donc mesuré la fraction d’excrétion urinaire de phosphate (FePO4) après hépatectomie partielle et nous avons étudié le rôle de la parathormone (PTH) et des phosphatonines dans cette hypophosphatémie. Méthodes : Les taux sériques de phosphate, de calcium ionisé, de PTH intacte, de « fibroblast growth factor- 23 » (FGF-23) intact et carboxyle-terminal, de FGF-7, de la « frizzled-related protein-4 » (FRP-4) et de HCO3- ainsi que le pH et la FePO4 ont été mesurés avant la chirurgie et aux jours postopératoires (po) 1, 2, 3, 5 et 7, chez 18 patients ayant subi une résection hépatique partielle. Résultats : Le phosphate sérique était à son plus bas niveau (0,66 ± 0,33 mmol/l; p < 0,001) au jour po 2. La FePO4 culminait à 25,07 ± 2,26 % au jour po 1 (p < 0,05) et était associée avec le taux de la parathormone intacte (r = 0,65; p = 0,006). Le calcium ionisé sérique diminuait à 1,1 ± 0,01 mmol/l, (p < 0,01) en même temps que la parathormone intacte s’élevait à 8,8 ± 0,9 pmol/l, (p < 0,01) au jour po 1; ces deux paramètres étaient inversement corrélés (r = -0,062; p = 0,016). Le FGF-23 intact atteignait son plus bas niveau à 7,8 ± 6,9 pg/ml (p < 0,001), au jour po 3; les valeurs de FGF-23 étaient corrélées avec la diminution du phosphate sérique aux jours po 0, 3, 5 et 7 (p < 0,001). Le FGF-23 carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4 n’étaient pas reliés au phosphate sérique ni à la FePO4. Conclusion : L’hypophosphatémie observée après résection hépatique partielle est liée à une augmentation de la FePO4 qui est sans aucune relation avec les FGF-23 intact ou carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4. La PTH intacte était associée avec la FePO4 uniquement au jour po 1. L’hypophosphatémie après résection hépatique est secondaire à d’autres facteurs non encore identifiés. / Background: Post-hepatectomy hypophosphatemia, first associated with metabolic demands by the regenerating liver, has recently been related to an excessive fractional urinary phosphate excretion (FePO4). We decided to investigate the role of parathyroid hormone (PTH) and of phosphatonins in the latter finding. Methods: Serum phosphate (PO4), ionized calcium (Ca++), HCO3-, pH and FePO4, Intact PTH, carboxyl-terminal and Intact fibroblast growth factor 23 (FGF-23), FGF-7 and frizzled related-protein-4 (FRP-4) were measured before and serially on post-operative days 1, 2, 3, 5 and 7, in 18 patients undergoing liver resection. Results: Serum PO4 was lowest (0.66 ± 0.33 mmol/l; p < 0.001) on po day 2. FePO4 peaked at 25.07 ± 2.26 % on po day 1 (p < 0.05) and was associated with Intact PTH levels (r = 0.65, p = 0.006). Decreased Ca++ levels (1.1 ± 0.01 mmol/l; p < 0.01) and increased Intact PTH levels (8.8 ± 0.9 pmol/l; p < 0.01) observed on po day 1 were negatively related (r = -0.62, p = 0.016). Intact FGF-23 decreased to its nadir 7.8 ± 6.9 pg/ml (p < 0.001), on po day 3 and was correlated with PO4 levels on po days 0, 3, 5 and 7 (p < 0.001). Carboxyl-terminal FGF-23, FGF-7 and FRP-4 levels could not be related either to PO4 concentrations or FePO4. Conclusion: Post-hepatectomy hypophosphatemia is related to an increased FePO4 unrelated to Intact FGF-23 or carboxyl-terminal FGF-23, FGF-7 or FRP-4. I-PTH contributes to excessive FePO4 on po day 1 but not thereafter. Other factors not yet defined should explain post hepatectomy hypophosphatemia.

Introduction : L’hypophosphatémie survient couramment après hépatectomie partielle. La régénération du foie était l’explication initiale. Cependant, les pertes rénales de phosphate observées récemment suggèrent que l’hypophosphatémie est probablement d’origine rénale. Nous avons donc mesuré la fraction d’excrétion urinaire de phosphate (FePO4) après hépatectomie partielle et nous avons étudié le rôle de la parathormone (PTH) et des phosphatonines dans cette hypophosphatémie. Méthodes : Les taux sériques de phosphate, de calcium ionisé, de PTH intacte, de « fibroblast growth factor- 23 » (FGF-23) intact et carboxyle-terminal, de FGF-7, de la « frizzled-related protein-4 » (FRP-4) et de HCO3- ainsi que le pH et la FePO4 ont été mesurés avant la chirurgie et aux jours postopératoires (po) 1, 2, 3, 5 et 7, chez 18 patients ayant subi une résection hépatique partielle. Résultats : Le phosphate sérique était à son plus bas niveau (0,66 ± 0,33 mmol/l; p < 0,001) au jour po 2. La FePO4 culminait à 25,07 ± 2,26 % au jour po 1 (p < 0,05) et était associée avec le taux de la parathormone intacte (r = 0,65; p = 0,006). Le calcium ionisé sérique diminuait à 1,1 ± 0,01 mmol/l, (p < 0,01) en même temps que la parathormone intacte s’élevait à 8,8 ± 0,9 pmol/l, (p < 0,01) au jour po 1; ces deux paramètres étaient inversement corrélés (r = -0,062; p = 0,016). Le FGF-23 intact atteignait son plus bas niveau à 7,8 ± 6,9 pg/ml (p < 0,001), au jour po 3; les valeurs de FGF-23 étaient corrélées avec la diminution du phosphate sérique aux jours po 0, 3, 5 et 7 (p < 0,001). Le FGF-23 carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4 n’étaient pas reliés au phosphate sérique ni à la FePO4. Conclusion : L’hypophosphatémie observée après résection hépatique partielle est liée à une augmentation de la FePO4 qui est sans aucune relation avec les FGF-23 intact ou carboxyle-terminal, le FGF-7 et la FRP-4. La PTH intacte était associée avec la FePO4 uniquement au jour po 1. L’hypophosphatémie après résection hépatique est secondaire à d’autres facteurs non encore identifiés. / Background: Post-hepatectomy hypophosphatemia, first associated with metabolic demands by the regenerating liver, has recently been related to an excessive fractional urinary phosphate excretion (FePO4). We decided to investigate the role of parathyroid hormone (PTH) and of phosphatonins in the latter finding. Methods: Serum phosphate (PO4), ionized calcium (Ca++), HCO3-, pH and FePO4, Intact PTH, carboxyl-terminal and Intact fibroblast growth factor 23 (FGF-23), FGF-7 and frizzled related-protein-4 (FRP-4) were measured before and serially on post-operative days 1, 2, 3, 5 and 7, in 18 patients undergoing liver resection. Results: Serum PO4 was lowest (0.66 ± 0.33 mmol/l; p < 0.001) on po day 2. FePO4 peaked at 25.07 ± 2.26 % on po day 1 (p < 0.05) and was associated with Intact PTH levels (r = 0.65, p = 0.006). Decreased Ca++ levels (1.1 ± 0.01 mmol/l; p < 0.01) and increased Intact PTH levels (8.8 ± 0.9 pmol/l; p < 0.01) observed on po day 1 were negatively related (r = -0.62, p = 0.016). Intact FGF-23 decreased to its nadir 7.8 ± 6.9 pg/ml (p < 0.001), on po day 3 and was correlated with PO4 levels on po days 0, 3, 5 and 7 (p < 0.001). Carboxyl-terminal FGF-23, FGF-7 and FRP-4 levels could not be related either to PO4 concentrations or FePO4. Conclusion: Post-hepatectomy hypophosphatemia is related to an increased FePO4 unrelated to Intact FGF-23 or carboxyl-terminal FGF-23, FGF-7 or FRP-4. I-PTH contributes to excessive FePO4 on po day 1 but not thereafter. Other factors not yet defined should explain post hepatectomy hypophosphatemia.