Der IGF1R gehört zur Familie der transmembranären Tyrosinkinaserezeptoren. Als Mediator der biologischen Effekte von IGF1 und IGF2 belegt er eine zentrale Rolle im Zellwachstum und der Zelldifferenzierung. Seit 2003 wurden bis heute über 20, vor allem heterozygote IGF1R Mutationen publiziert. Die erste der bisher zwei veröffentlichten homozygoten IGF1R Mutationen erschien im Jahr 2012. Bis zu diesem Zeitpunkt legten Untersuchungen transgener IGF1R knockout Mäuse eine Unvereinbarkeit solcher Mutationen mit dem Leben nahe. Versuche zeigten, dass die mutationstragenden Mäuse unmittelbar nach Geburt an respiratorischem Versagen starben. Hieraus wurde abgeleitet, dass humane homozygote Mutationsträger mit komplettem Funktionsverlust ebenfalls nicht lebensfähig wären. Ziel dieser Arbeit war die molekularbiologische Aufarbeitung des zum damaligen Zeitpunkt noch einzigartigem homozygoten Trägerstatus der Indexpatientin. Das Interesse lag vor allem auf der Genotyp-Phänotyp Korrelation, da es sich aller Wahrscheinlichkeit nach nicht um einen völligen Funktionsverlust der Allele handeln konnte. Bei dieser Patientin lag eine Missense Mutation – Aminosäureaustausch von Glutamat zu Aspartat an Position 56 des IGF1R – in der ligandenbindenden Domäne L1 vor. Phänotypisch zeigte die Patientin neben ihrem proportionierten Kleinwuchs, ein rundes Puppengesicht mit großen Augen, sehr dichten schwarzen Augenbrauen und einem dichten Kopfhaarwuchs mit einem tiefen nuchalen Haaransatz. Die molekularbiologische Untersuchung dieser Mutation erfolgte sowohl an Hautfibroblasten der Indexpatientin als auch rekombinant in Säugerzellen. Die in vitro Untersuchungen dieser homozygoten IGF1R(E56D) Mutation, legten im Wesentlichen folgende Ergebnisse dar: 1. Die Expression der IGF1R Untereinheiten wurde mittels Immunoblotting untersucht und zeigte im Falle des mutierten Rezeptors eine substantielle Erhöhung des Prorezeptors auf Kosten der reifen α- und β-Untereinheiten. Dies lässt auf eine gestörte Prozessierung in die Rezeptoruntereinheiten schließen. 2. Die IGF1 induzierte Autophosphorylierungskapazität des mutierten Rezeptors, ebenfalls mittels Immunoblot visualisiert, war substantiell verringert. Eine Quantifizierung der pIGF1R Signale auf das Gesamtprotein im Vergleich zur Normalisierung auf den unphosphorylierten IGF1R legte nahe, dass die Aktivierungskinetik des mutierten Rezeptors unverändert ist. Anzunehmen ist, dass aufgrund der fehlerhaften Prozessierung des Prorezeptors der funktionelle IGF1R quantitativ beeinträchtigt ist. 3. Eine Abnahme der Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade, die anhand des Signalproteins B/AKT untersucht wurde, konnte nicht in allen untersuchten Zelllinien bestätigt werden. 4. Die Oberflächenexpression des mutationstragenden Rezeptors wurde im Durchflusszytometer untersucht. Einhergehend mit der verminderten Expression reifer IGF1R Untereinheiten war die Oberflächenexpression des Rezeptors signifikant verringert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Mutation quantitative Auswirkung auf die Prozessierung und Oberflächenexpression des IGF1R hat. Im Gegensatz zum völligen Funktionsverlust des Rezeptors im knock-out Mausmodell, bestand hier eine Restaktivität, weshalb man von einem hypomorphen Charakter dieser Mutation spricht. Diese Ergebnisse lassen auf einen kausalen Zusammenhang zwischen der Mutation und dem IGF1-resistenten Phänotyp der Schwestern schließen. Phänotypisch ähneln biallele Mutationsträger den bisher publizierten heterozygoten Individuen. Die biallelen Indexpatienten zeigen allerdings eine ausgeprägtere Hormonresistenz, einen markanteren Wachstumsrückstand und vermehrt Komorbiditäten (z.B. Störungen der Glukosehomöostase). Eine Korrelation dieser Merkmale mit der Lokalisation der Mutation und dem Trägerstatus lässt sich allerdings erst mit der Identifizierung weiterer Patienten endgültig klären.:Inhaltsverzeichnis 2 1.1 Wachstum als lebenslanger Prozess 3 1.2 IGF1 und IGF2 in der pränatalen Wachstumsphase 4 1.3 Die Ätiologie und Pathogenese des Kleinwuchses 5 1.5 Pathologien der somatotropen Achse 8 1.6 Der Insulin-like growth factor 1 Rezeptor 9 1.7 IGF1R Mutationen 13 2 Fragestellung 14 3 Material und Methoden 15 3.1 Patientin 15 3.2 Molekulargenetik 16 3.3 Molekularbiologie 17 3.3.1 Basismethoden 17 3.3.2 Plasmide, Klonierungen und ortsgerichtete Mutagenese 18 3.4 Zellkultur 19 3.4.1 Transiente Transfektion 21 3.4.2 Immunoblotting 21 3.4.3. Durchflusszytometrie 23 4. Ergebnisse 24 4.1 Klinisches Bild und Genotypisierung der Patientin 24 4.2 Expression der IGF1R Untereinheiten 31 4.3 IGF1R Autophosphorylierung und intrazelluläre Signaltransduktion 32 4.4 Oberflächenexpression des IGF1R 37 5. Diskussion 38 5.1 Der homozygote Charakter der Mutation 38 5.2 Die Genotyp-Phänotyp Korrelation 42 6. Zusammenfassung der Arbeit 46 Literaturverzeichnis 48 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 57 Lebenslauf 58 Danksagung 60 7. Anhang 61 7.1 Abbildungsverzeichnis 61 7.2 Tabellenverzeichnis 61 7.3 Abkürzungsverzeichnis 62 7.4 Aminosäurecodes 65