Die Regulation des Kohlenstoffkatabolismus erfolgt in Escherichia coli wesentlich über den Einfluss der intrazellulären cAMP-Konzentration auf die Expression der Gene des crpA-Modulon. cAMP wird durch die Adenylatzyklase CyaA synthetisiert, die wiederum durch phosphoryliertes IIACrr aktiviert wird. Im Rahmen eines Stoffwechselmodellierungsprojektes sollten durch die Entwicklung von Systemen zur quantitativen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration und des Phosphorylierungszustands von IIACrr zwei entscheidende Parameter dieses Regulationsnetzwerkes untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde ein System zur reproduzierbaren, direkten Messung der intrazellulären cAMP-Konzentration in E. coli etabliert. Zur in vivo Bestimmung der intrazellulären cAMP-Konzentration wurden zwei verschiedene durch cAMP·CrpA regulierte Promotoren mit den Reportergenen für ß-Galaktosidase oder Aequorin (grün fluoreszierendes Protein) fusioniert und in drei verschiedenen Messkonstrukten untersucht. Die Zugabe von Pyruvat zu gehungerten Zellen führte zu einer Desphosphorylierung von IIACrr. Der so direkt gezeigte Einfluss des PEP/Pyruvat Verhältnisses auf das Phosphorylierungsgleichgewicht von IIACrr zeigt einen Mechanismus, über den PTS-unabhängige Substrate den Phosphorylierungszustand von IIACrr verändern und somit die Aktivität der Adenylatzyklase beeinflussen können. Bei der Untersuchung zur zellulären Lokalisation der Adenylatzyklase in E. coli mit Hilfe einer CyaA-Aequorin-Fusion wurde nach Überexpression des Fusionsproteins eine lokale Anhäufung der Fluoreszenz an den Zellpolen beobachtet. Da bei geringerer Expression der Fusion kein Fluoreszenzsignal mehr erfasst werden konnte, war eine endgültige Lokalisierung der Adenylatzklase mit dieser Methode nicht möglich.

Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Stoffwechselmodellierungsprojektes von Escherichia coli K-12. Grundlage dieses Projektes ist ein neuartiges Konzept, welches das zelluläre System in funktionelle Einheiten einteilt. Eine wichtige Einheit stellt die Nahrungssuche dar, die alle Gene und Genprodukte, die im Zusammenhang mit dem Kohlenstoff-Katabolismus, der Glykolyse/Glukoneogenese und der Energiegewinnung stehen, beinhaltet. Die Definition von funktionellen Einheiten erfolgt nach drei Kriterien: Gemeinsames physiologische Ziel Gemeinsame genetische Einheit Gemeinsames Signaltransduktionsnetzwerk. Eine besondere Stellung innerhalb der funktionellen Einheit Nahrungssuche nimmt das PEP zu Pyruvat Verhältnis ein. Es verbindet die Glykolyse/Glukoneogenese mit den PTSs und dem TCA-Zyklus. Die Zelle hat die Möglichkeit über dieses Verhältnis die katabolischen Aktivitäten zu messen und diese Informationen in einen intrazellulären Spiegel des Alarmons cAMP umzusetzen, durch den die Zelle der katabolischen Situation angemessen reagieren kann. Das Verhältnis von PEP zu Pyruvat wurde im Zuge dieser Arbeit weitergehend untersucht: 1) Das Verhältnis sollte von außen durch die Zugabe von Pyruvat verändert und die Reaktion auf die Phosphotransferasesysteme anhand des Phosphorylierungszustandes der PTS-Komponente EIIACrr verfolgt werden. 2) Das Verhältnis von PEP zu Pyruvat wird direkt durch die Enzyme EI, PEP-Synthase und Pyruvat-Kinase A und F eingestellt. Die Glykolyse/Glukoneogenese Enzyme wurden anhand ihrer Genexpression genauer Untersucht.