As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Embora estas mutações estejam causalmente relacionadas à oncogênese, até hoje diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis é necessário identificar os mecanismos moleculares ativados por KRAS que estão diretamente envolvidos com a aquisição de propriedades malignas importantes, como o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs, também conhecidas como células tronco-tumorais, são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar a formação de tumores e sustentar o crescimento tumoral. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que KRAS está associada a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral e ativa o fator de transcrição NF-kB através da quinase IKKβ para promover a tumorigênese pulmonar, nós hipotetizamos que a quinase IKKβ contribui para o fenótipo tronco-tumoral induzido por KRAS em câncer de pulmão. Nós utilizamos ensaios de formação de tumoresferas para enriquecer e avaliar a função de CITs das linhagens pulmonares positivas para KRAS A549 e H358. As células A549 e H358 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às células derivadas da cultura aderente, as células oriundas da cultura de tumoresferas apresentaram maior crescimento clonogênico, maior expressão de genes associados ao fenótipo tronco por qPCR e maior atividade da quinase IKKβ. A inibição da atividade de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente específico (Composto A) diminuiu levemente a proliferação de células A549 e H358, sem resultar em morte celular significativa. Entretanto, a inibição da atividade ou da expressão de IKKβ por interferência de RNA reduziu a expressão de genes associados ao fenótipo tronco e diminuiu a formação de tumoresferas. A inibição da expressão de IKKβ em células A549 reduziu também a capacidade de autorrenovação de CITs. Estes resultados sugerem que IKKβ desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo tronco-tumoral de CITs pulmonares induzidas por KRAS. Em seguida, nós demonstramos que a inibição da atividade de IKKβ afetou preferencialmente a proliferação celular e o crescimento clonogênico de células oriundas da cultura de tumoresfera, sugerindo que IKKβ desempenha um papel mais importante em CITs do que em células derivadas da cultura aderente. A análise por citometria de fluxo identificou que células derivadas da cultura de tumoresfera apresentam um enriquecimento para células CD24+ na linhagem A549 e células CD44+ na linhagem H358, sugerindo que estes possam ser marcadores promissores para purificação de CITs nestas linhagens. Adicionalmente, demonstramos, por ensaios de wound-healing de células A549 e H358, que a inibição da atividade de IKKβ reduziu a migração celular, uma outra uma propriedade aumentada em CITs. Além disso, mostramos que a atividade da quinase IKKβ em células A549 e H358 não depende das vias da MAPK ou PI3K/Akt. Interessantemente, a inibição combinada de IKK (um efetor downstream de KRAS) e de EGFR/ERRB2 (reguladores upstream de KRAS que ativam as vias MAPK e PI3K/Akt) reduziu de forma aditiva a formação de tumoresferas, proliferação e migração celular. Quando avaliados em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante na biologia de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e que a inibição desta quinase sozinha ou em combinação com a inibição de outras vias pode representar uma estratégia terapêutica promissora a ser explorada para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / The most frequent genetic alterations in lung cancer are point mutations that activate the KRAS oncogene. Although these mutations are causally related to oncogenesis, different approaches to inhibit RAS proteins directly have not been successful to date. Therefore, for better therapeutic targets for lung cancer to become available, it is necessary to identify the molecular mechanisms activated by KRAS that are directly involved with important malignant features, such as the development and maintenance of a cancer stem-like phenotype by the tumour-initiating cells (TICs). TICs, also known as cancer stem cells, are defined as a subpopulation of tumour cells able to self-renew, promote tumour initiation, and sustain tumour growth. The development of therapeutic strategies to target these cells is imperative to improve the efficacy of antitumor therapy. Since KRAS is associated with the maintenance of a cancer stem-like phenotype and activates the transcription factor NF-kB through the IKKβ kinase to promote lung tumourigenesis, we hypothesised that IKKβ kinase contributes to the cancer stem-like phenotype induced by KRAS in lung cancer. We used tumoursphere formation assays to enrich and evaluate the function of TICs of KRAS-mutant cell lines A549 and H358. A549 and H358 cells formed tumourspheres in low adhesion culture and, when compared to cells grown in adherent culture, sphere-derived cells displayed increased clonogenic growth, higher expression of stemness genes by qPCR, and increased IKKβ kinase activity . Inhibition of IKKβ activity through a highly specific pharmacological inhibitor (Compound A) slightly decreased proliferation of A549 and H358 cells without inducing significant cell death. On the other hand, inhibition of IKKβ activity or expression by RNA interference reduced the expression of stemness genes and decreased tumoursphere formation. Inhibition of IKKβ expression in A549 cells also reduced TICs self-renewal . These results suggest that IKKβ plays an important role in maintaining the cancer stem-like phenotype of KRAS-driven lung TICs. Next, we demonstrated that IKKβ inhibition preferentially reduced cell proliferation and clonogenic growth of sphere-derived cells, suggesting that IKKβ plays a more important role in TICs than in adherent culture-derived cells. Flow cytometry analysis identified that sphere-derived cells display an enrichment for the surface marker CD24 in A549 cells and CD44 in H358 cells, indicating that these could be promising markers for the purification of TICs in these cell lines. Furthermore, we have shown by wound-healing assays of A549 and H358 cells that IKKβ inhibition reduced cell migration , another feature increased in TICs. In addition, we have shown that IKKβ activity in A549 and H358 cells does not depend on the MAPK or PI3K/Akt pathways. Interestingly, combined inhibition of IKKβ (a downstream effector of KRAS) and EGFR/ERBB2 (upstream regulators of KRAS that activate the MAPK and PI3K/Akt pathways) additively reduced tumoursphere formation, cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that IKKβ kinase plays an important role in the biology of KRAS-driven lung TICs, and that inhibition of this kinase alone or in combination with inhibition of other signalling pathways may represent a promising therapeutic strategy to be explored in order to reduce tumour recurrence and metastasis in KRAS-driven lung cancer.

As alterações genéticas mais frequentes em câncer de pulmão são mutações pontuais que ativam o oncogene KRAS. Embora estas mutações estejam causalmente relacionadas à oncogênese, até hoje diferentes abordagens para inibir as proteínas RAS diretamente não obtiveram sucesso. Portanto, para que melhores alvos terapêuticos para o câncer de pulmão se tornem disponíveis é necessário identificar os mecanismos moleculares ativados por KRAS que estão diretamente envolvidos com a aquisição de propriedades malignas importantes, como o desenvolvimento e a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs). CITs, também conhecidas como células tronco-tumorais, são definidas como uma subpopulação de células tumorais capazes de se autorrenovar, iniciar a formação de tumores e sustentar o crescimento tumoral. O desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas a estas células é imprescindível para melhorar a eficácia da terapia antitumoral. Uma vez que KRAS está associada a manutenção de um fenótipo tronco-tumoral e ativa o fator de transcrição NF-kB através da quinase IKKβ para promover a tumorigênese pulmonar, nós hipotetizamos que a quinase IKKβ contribui para o fenótipo tronco-tumoral induzido por KRAS em câncer de pulmão. Nós utilizamos ensaios de formação de tumoresferas para enriquecer e avaliar a função de CITs das linhagens pulmonares positivas para KRAS A549 e H358. As células A549 e H358 formaram tumoresferas em cultura de baixa aderência e, quando comparadas às células derivadas da cultura aderente, as células oriundas da cultura de tumoresferas apresentaram maior crescimento clonogênico, maior expressão de genes associados ao fenótipo tronco por qPCR e maior atividade da quinase IKKβ. A inibição da atividade de IKKβ através de um inibidor farmacológico altamente específico (Composto A) diminuiu levemente a proliferação de células A549 e H358, sem resultar em morte celular significativa. Entretanto, a inibição da atividade ou da expressão de IKKβ por interferência de RNA reduziu a expressão de genes associados ao fenótipo tronco e diminuiu a formação de tumoresferas. A inibição da expressão de IKKβ em células A549 reduziu também a capacidade de autorrenovação de CITs. Estes resultados sugerem que IKKβ desempenha um papel importante na manutenção do fenótipo tronco-tumoral de CITs pulmonares induzidas por KRAS. Em seguida, nós demonstramos que a inibição da atividade de IKKβ afetou preferencialmente a proliferação celular e o crescimento clonogênico de células oriundas da cultura de tumoresfera, sugerindo que IKKβ desempenha um papel mais importante em CITs do que em células derivadas da cultura aderente. A análise por citometria de fluxo identificou que células derivadas da cultura de tumoresfera apresentam um enriquecimento para células CD24+ na linhagem A549 e células CD44+ na linhagem H358, sugerindo que estes possam ser marcadores promissores para purificação de CITs nestas linhagens. Adicionalmente, demonstramos, por ensaios de wound-healing de células A549 e H358, que a inibição da atividade de IKKβ reduziu a migração celular, uma outra uma propriedade aumentada em CITs. Além disso, mostramos que a atividade da quinase IKKβ em células A549 e H358 não depende das vias da MAPK ou PI3K/Akt. Interessantemente, a inibição combinada de IKK (um efetor downstream de KRAS) e de EGFR/ERRB2 (reguladores upstream de KRAS que ativam as vias MAPK e PI3K/Akt) reduziu de forma aditiva a formação de tumoresferas, proliferação e migração celular. Quando avaliados em conjunto, nossos resultados sugerem que a quinase IKKβ desempenha um papel importante na biologia de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e que a inibição desta quinase sozinha ou em combinação com a inibição de outras vias pode representar uma estratégia terapêutica promissora a ser explorada para reduzir a recidiva e metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS. / The most frequent genetic alterations in lung cancer are point mutations that activate the KRAS oncogene. Although these mutations are causally related to oncogenesis, different approaches to inhibit RAS proteins directly have not been successful to date. Therefore, for better therapeutic targets for lung cancer to become available, it is necessary to identify the molecular mechanisms activated by KRAS that are directly involved with important malignant features, such as the development and maintenance of a cancer stem-like phenotype by the tumour-initiating cells (TICs). TICs, also known as cancer stem cells, are defined as a subpopulation of tumour cells able to self-renew, promote tumour initiation, and sustain tumour growth. The development of therapeutic strategies to target these cells is imperative to improve the efficacy of antitumor therapy. Since KRAS is associated with the maintenance of a cancer stem-like phenotype and activates the transcription factor NF-kB through the IKKβ kinase to promote lung tumourigenesis, we hypothesised that IKKβ kinase contributes to the cancer stem-like phenotype induced by KRAS in lung cancer. We used tumoursphere formation assays to enrich and evaluate the function of TICs of KRAS-mutant cell lines A549 and H358. A549 and H358 cells formed tumourspheres in low adhesion culture and, when compared to cells grown in adherent culture, sphere-derived cells displayed increased clonogenic growth, higher expression of stemness genes by qPCR, and increased IKKβ kinase activity . Inhibition of IKKβ activity through a highly specific pharmacological inhibitor (Compound A) slightly decreased proliferation of A549 and H358 cells without inducing significant cell death. On the other hand, inhibition of IKKβ activity or expression by RNA interference reduced the expression of stemness genes and decreased tumoursphere formation. Inhibition of IKKβ expression in A549 cells also reduced TICs self-renewal . These results suggest that IKKβ plays an important role in maintaining the cancer stem-like phenotype of KRAS-driven lung TICs. Next, we demonstrated that IKKβ inhibition preferentially reduced cell proliferation and clonogenic growth of sphere-derived cells, suggesting that IKKβ plays a more important role in TICs than in adherent culture-derived cells. Flow cytometry analysis identified that sphere-derived cells display an enrichment for the surface marker CD24 in A549 cells and CD44 in H358 cells, indicating that these could be promising markers for the purification of TICs in these cell lines. Furthermore, we have shown by wound-healing assays of A549 and H358 cells that IKKβ inhibition reduced cell migration , another feature increased in TICs. In addition, we have shown that IKKβ activity in A549 and H358 cells does not depend on the MAPK or PI3K/Akt pathways. Interestingly, combined inhibition of IKKβ (a downstream effector of KRAS) and EGFR/ERBB2 (upstream regulators of KRAS that activate the MAPK and PI3K/Akt pathways) additively reduced tumoursphere formation, cell proliferation and migration. Taken together, our results suggest that IKKβ kinase plays an important role in the biology of KRAS-driven lung TICs, and that inhibition of this kinase alone or in combination with inhibition of other signalling pathways may represent a promising therapeutic strategy to be explored in order to reduce tumour recurrence and metastasis in KRAS-driven lung cancer.