Regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen sind essentiell für das Gleichgewicht des intestinalen Immunsystems. Eine Einschränkung ihrer Suppressionsfunktion wird bei Patienten mit Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom beobachtet und führt im Tiermodell zu lymphoproliferativen Erkrankungen und intestinalen Entzündungen. Von entscheidender Bedeutung für Homöostase und Suppressionsfunktion regulatorischer T-Zellen ist das Signalmolekül Interleukin-2 (IL-2). Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen exprimieren Foxp3+CD4+ T-Zellen den hochaffinen IL-2-Rezeptor αβγ konstitutiv. IL-2 wird von regulatorischen T-Zellen nicht in relevanten Mengen exprimiert. Sie sind somit auf von anderen Zellen sezerniertes IL-2 angewiesen. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass im Tiermodell regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen durch Applikation eines IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex nicht nur in mesenterialen Lymphknoten und Milz, sondern auch lokal in der Lamina propria mucosae des Kolons der Versuchstiere expandiert werden. Als relevante Quelle von IL-2 in situ könnten aktivierte proliferierende T-Zellen dienen. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Proteinexpression proliferierender Einzelzellen mittels Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight-Massenspektrometrie-Imaging (MALDI-Imaging) analysiert. Es gelang die Identifikation präferentiell in lymphoiden Geweben exprimierter Peptidmassen. Obwohl die Einzelzellanalyse mittels MALDI-Imaging prinzipiell möglich erscheint, ist ein Nachweis von Zytokinen wie IL-2 derzeit aufgrund fehlender Sensitivität im Proteinmassebereich zwischen 10kDa und 20kDa nicht möglich. Die therapeutischen Möglichkeiten der Expansion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen durch stabile IL-2-Rezeptor-Agonisten und die Rolle von IL-2 für die intestinale Immunregulation sollten weiter untersucht werden.

Regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen sind essentiell für das Gleichgewicht des intestinalen Immunsystems. Eine Einschränkung ihrer Suppressionsfunktion wird bei Patienten mit Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX)-Syndrom beobachtet und führt im Tiermodell zu lymphoproliferativen Erkrankungen und intestinalen Entzündungen. Von entscheidender Bedeutung für Homöostase und Suppressionsfunktion regulatorischer T-Zellen ist das Signalmolekül Interleukin-2 (IL-2). Im Gegensatz zu Effektor-T-Zellen exprimieren Foxp3+CD4+ T-Zellen den hochaffinen IL-2-Rezeptor αβγ konstitutiv. IL-2 wird von regulatorischen T-Zellen nicht in relevanten Mengen exprimiert. Sie sind somit auf von anderen Zellen sezerniertes IL-2 angewiesen. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass im Tiermodell regulatorische Foxp3+CD4+ T-Zellen durch Applikation eines IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex nicht nur in mesenterialen Lymphknoten und Milz, sondern auch lokal in der Lamina propria mucosae des Kolons der Versuchstiere expandiert werden. Als relevante Quelle von IL-2 in situ könnten aktivierte proliferierende T-Zellen dienen. Um dies näher zu untersuchen, wurde die Proteinexpression proliferierender Einzelzellen mittels Matrix assisted laser desorption/ionisation-Time of flight-Massenspektrometrie-Imaging (MALDI-Imaging) analysiert. Es gelang die Identifikation präferentiell in lymphoiden Geweben exprimierter Peptidmassen. Obwohl die Einzelzellanalyse mittels MALDI-Imaging prinzipiell möglich erscheint, ist ein Nachweis von Zytokinen wie IL-2 derzeit aufgrund fehlender Sensitivität im Proteinmassebereich zwischen 10kDa und 20kDa nicht möglich. Die therapeutischen Möglichkeiten der Expansion regulatorischer Foxp3+ T-Zellen durch stabile IL-2-Rezeptor-Agonisten und die Rolle von IL-2 für die intestinale Immunregulation sollten weiter untersucht werden.:Bibliographische Beschreibung 3 Inhaltsverzeichnis 4 Abkürzungsverzeichnis 7 1. Einleitung 9 1.1. Störung der Barrierefunktion des intestinalen Immunsystems als Ursache chronisch entzündlicher Darmerkrankungen 9 1.2. Foxp3+ regulatorische T-Zellen 10 1.3. Die Rolle von Interleukin-2 für regulatorische T-Zellen 11 1.4. Signaltransduktion in regulatorischen T-Zellen als Grundlage ihrer selektiven Expansion und Induktion 12 1.5. Möglichkeiten der präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen 15 1.5.1. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Agonisten des hochaffinen IL-2-Rezeptors 15 1.5.2. Induktion regulatorischer T-Zellen durch TGF-β 16 1.5.3. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Rapamycin (Sirolimus) 17 1.5.4. Expansion regulatorischer T-Zellen durch UVB-Bestrahlung bzw. Vitamin D-Rezeptor-Agonisten 18 1.5.5. Expansion regulatorischer T-Zellen durch Histon-Deacetylaseinhibitoren 19 1.6. Suppression von Effektor-T-Zellen durch regulatorische T-Zellen 20 1.6.1. Zellkontaktabhängige Mechanismen 20 1.6.2. Zellkontaktunabhängige Mechanismen 22 1.7. Matrix assisted laser desorption ionisation-Time of flight-Massenspektromie (MALDI-TOF-MS): Bedeutung und Funktion 23 1.8. Zielstellung 25 2. Materialien und Methoden 26 2.1. Versuchstiere 26 2.2. IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperiment 26 2.2.1. Induktion von 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS)-Kolitis 26 2.2.2. Durchführung des IL-2/IgG2b-Fusionsprotein-Vorexperimentes 26 2.3. Durchführung des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex-Experiments 27 2.4. Durchflusszytometrie 27 2.5. Histologische Färbungen 28 2.5.1. Probenvorbereitung 28 2.5.2. Hämatoxylin/Eosin (HE) Färbung 29 2.5.3. Immunfluoreszenz-Färbungen 29 2.5.4. Ki67-Schnellfärbung 30 2.5.5. Mikroskopie und Photographie 30 2.6. Histologische Auswertungen 31 2.6.1. Kolitis-Score 31 2.6.2. Bildanalyse 31 2.6.3. Validierung der automatischen Bildanalyse mittels CellProfiler 33 2.7. MALDI-Imaging 35 2.7.1. Probenvorbereitung für MALDI-Imaging 35 2.7.2. Analyse der Peptidexpression in Gewebeschnitten mittels MALDI-Imaging 36 2.8. Statistische Auswertungen 36 2.8.1. Statistische Tests 36 2.8.2. Berechnung der zu erwartenden Zahl von Kontakten zwischen Ki67+ und Foxp3+ Zellen 36 3. Ergebnisse 38 3.1. Design des IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex Experimentes 38 3.2. Mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex behandelte Tiere zeigen Splenomegalie und Lymphadenomegalie 40 3.3. Behandlung mit einem IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten und Milz 41 3.4. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt nicht zu Kolitis 43 3.5. Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae 45 3.6. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex steigert die Proliferation regulatorischer T-Zellen in der Lamina propria mucosae und lymphoiden Follikeln des Kolons 47 3.7. Regulatorische T-Zellen sind nach Behandlung mit IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex weiter mit proliferierenden Zellen assoziiert. 50 3.8. MALDI-Imaging als Möglichkeit der Proteinexpressionsanalyse in situ 52 3.8.1. Vergleich der Proteinexpression in verschiedenen Geweben von Ileum und Zäkum mit der Expression in Thymus und mesenterialem Lymphknoten 55 3.8.2. MALDI-Imaging nach Schnellfärbung Ki67+ Zellen mit Streptavidin 63 3.8.3. Analyse der Massenspektren von Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 66 4. Diskussion 68 4.1. Applikation von IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex hat keine fatalen Nebenwirkungen 68 4.2. IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex führt zur präferentiellen Expansion regulatorischer T-Zellen in mesenterialen Lymphknoten, Milz und Kolon 70 4.3. IL-10 als wichtiger Vermittler der Suppressionsaktivität durch IL-2/anti-IL-2-Antikörperkomplex expandierter regulatorischer T-Zellen 71 4.4. Expansion regulatorischer T-Zellen beim Menschen: Voraussetzungen und Chancen 72 4.5. Regulatorische T-Zellen akkumulieren an proliferierenden Zellen 73 4.6. Nachweis spezifischer Massen in Gewebe und Einzelzellen mittels MALDI-Imaging 74 5. Zusammenfassung 80 Literaturverzeichnis 83 Publikationen 90 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 97 Lebenslauf 98 Danksagungen 99