L’érythropoïèse constitue un processus continu et ordonné au cours duquel des progéniteursérythroides commis prolifèrent et se différencient en globules rouges. Au cours d’un criblage visant à identifierdes gènes dont l’expression est régulée au cours de la différenciation terminale, nous avons identifié ISG15comme un gène dont l’expression est induite dans les stades tardifs de la différenciation érythroïde. ISG15appartient à la famille des protéines apparentées à l’ubiquitine et est conjuguée directement à des résidus Lysinede protéines cibles. La séquence des évènements moléculaires qui président à la modification de résidus Lysinedes protéines par ISG15 (ISGylation) est très semblable à ceux mis en oeuvre dans l’ubiquitination des protéines.Nous avons montré que l’expression d’ISG15 et des enzymes liées au processus d’ISGylation Ube1L, UbcM8 etHerc6 est induite au cours de l’érythropoièse in vivo et aussi dans des érythroblastes en culture induits à sedifférencier en réponse à l’Epo. Grâce à ce système de culture in vitro, nous avons montré que l’induction de cesgènes est majoritairement indépendante de la voie de signalisation IFN, et partiellement dépendante de la voie designalisation Epo. La comparaison de l’érythropoïèse dans des souris contrôles et des souris dans lesquelles legène ISG15 a été inactivé (ISG15-/-), montre une diminution du nombre de progéniteurs BFU-E et CFU-E dansla moelle osseuse avec une augmentation des BFU-E/CFU-E dans la rate des animaux ISG15-/-. Nous avonsaussi montré que les érythroblastes ISG15-/- sont inhibés dans leur différenciation terminale, à la fois in vivo et invitro. A l’inverse, la surexpression d’ISG15 dans les érythroblastes se révèle faciliter la différenciationérythroide. Au niveau moléculaire, nous avons montré que des acteurs importants de la différenciation érythroidepeuvent être ISGylés, comme par exemple STAT5, Globine, PLCγ et ERK2. En ce qui concerne plusprécisément STAT5, nous avons montré que son ISGylation est induite au cours de la différenciation et avonscherché à identifier les conséquences de son ISGylation. Dans le contexte d’une protéine de fusion, STAT5ISGylée se lie mieux à son site de liaison à l’ADN, une propriété associée avec une régulation positive de TfR etBCL-XL, deux gènes précédemment décrits comme étant régulés par STAT5 dans les érythroblastes. L’ensemblede ces résultats établit un nouveau rôle pour ISG15 au cours de la différenciation érythroide, en plus de sesfonctions anti-virales bien caractérisées / Erythropoiesis is an orderly continuous process during which committed erythroid progenitorcells proliferate and differentiate into mature red blood cells. In a search for genes that are deregulated duringthis differentiation process, we have identified ISG15 as being induced during the late stages of erythroiddifferentiation. ISG15 belongs to the ubiquitin-like protein family and is covalently linked to target proteins bythe enzymes of the ISGylation machinery. Using both in vivo and in vitro differentiating erythroblasts, we haveshown that expression of ISG15 as well as the ISGylation process related enzymes Ube1L, UbcM8 and Herc6are induced during erythroid differentiation. Moreover, using in vitro differentiating erythroblasts, we haveshown that the induction of these genes is mostly independent of IFN signaling, while it is partially dependent onEpo signaling in these cells. Our analysis of the ISG15 deficient mice have shown a decreased number of BFUE/CFU-E in the bone marrow, associated with an increased number of these cells in the spleen of these animals,a phenotype reminiscent of stress erythropoiesis. While ISG15-/- bone marrow and spleen-derived erythroblastsshowed a less differentiated phenotype both in vivo and in vitro, over-expression of ISG15 in erythroblasts wasfound to facilitate erythroid differentiation. At the molecular level, we have shown that important effectors oferythroid differentiation can be ISGylated, including STAT5, Globin, PLCγ and ERK2. Attempt to identify theconsequences of ISGylation has only been performed for STAT5. When studied in the context of a fusionprotein, ISGylated STAT5 was found endowed with a higher capacity to bind DNA, a property associated withup-regulation of TfR and Bcl-XL, two genes previously described as being regulated by STAT5 during erythroiddifferentiation. This establishes a new role for ISG15, in addition to its well-characterized anti-viral functions,during erythroid differentiation.

Infektionen lösen eine Immunantwort aus, welche u.a. durch Induktion von Interferonen (IFN) für die Expression von antibakteriell oder antiviral wirkenden Proteinen sorgt. Eines der am stärksten induzierten Gene nach Typ I IFN Stimulation ist das Interferon stimulated gene 15 (ISG15). ISG15 gehört zu den Ubiquitin-ähnlichen Proteinen und wird über eine Enzymkaskade kovalent an zu modifizierende Proteine konjugiert. Sowohl freiem ISG15, als auch ISG15-Konjugaten wurden antivirale Funktionen nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Regulation von ISG15, der ISGylierung und der an der ISGylierung beteiligten Enzyme vergleichend nach Typ I und Typ II IFN Stimulation untersucht. In HeLa Zellen zeigte sich, dass ISG15 und ISG15-Konjugate sowohl nach Typ I, als auch nach Typ II IFN Stimulation gebildet werden. Die Unterschiede in der Menge der ISGylierten Proteine konnten in Zusammenhang mit der unterschiedlich starken Expression der an der ISGylierung beteiligten Enzyme gebracht werden. Durch Inhibition der Expression der einzelnen Enzyme wurde weiterhin nachgewiesen, dass nach Typ I und Typ II IFN Stimulation das gleiche E2-Enzym (UBE2L6), aber unterschiedliche E3-Ligasen an der ISGylierung beteiligt sind. Während die ISGylierung nach Typ I IFN Stimulation größtenteils von der E3-Ligase Herc5 abhängt, zeigte sich, dass nach Typ II IFN Stimulation weitere noch nicht identifizierte ISG15 E3-Ligasen an dem Prozess beteiligt sind. Microarry- und siRNA-Analysen führten zur Identifizierung der potentiellen ISG15 E3-Ligasen UBE3A und ARIH1. Dabei zeigte sich, dass UBE3A nach Typ I und ARIH1 nach Typ II IFN Stimulation einen Einfluss auf die ISGylierung von Proteinen haben. Diese Ergebnisse machen deutlich, dass in HeLa Zellen Typ I und Typ II Interferone die ISGylierung induzieren, wobei sich die Enzymkaskade zwischen den Interferonen auf Ebene der E3-Ligasen unterscheidet. Diese Ergebnisse geben neue Einblicke in die Regulation der IFN vermittelten ISGylierung. / Infections initiate the induction of an immune response that lead to induction of interferons followed by expression of antibacterial and antiviral proteins. One of the most upregulated genes after type I interferon (IFN) stimulation is the Interferon stimulated gene 15 (ISG15). ISG15 belongs to the family of ubiquitin-like modifiers and is covalently attached to target proteins via an enzyme cascade. It was shown that free ISG15 as well as ISG15-conjugates exhibit antiviral functions. In this thesis the regulation of ISG15, ISGylation and the involvement of enzymes after type I and type II IFN treatment were analysed. It could be demonstrated that ISG15 and ISG15-conjugates are generated after type I as well as type II IFN treatment in HeLa cells. Differences in the amount of ISGylated proteins were shown to correlate with the expression of proteins of the enzyme cascade. Inhibition of these enzymes demonstrated that the E2-enzyme UBE2L6 is involved in the ISGylation process after both types of IFN stimulation, whereas different E3-ligases are implicated in ISGylation of proteins after type I and type II IFN stimulation. It could be shown that the E3-ligase Herc5 is involved in type I IFN mediated ISGylation, whereas other not yet identified ISG15 E3-ligases are involved in type II IFN mediated ISGylation. Microarry- and siRNA-assays led to the identification of the putative ISG15 E3-ligases UBE3A and ARIH1, whereas UBE3A had an influence on type I IFN mediated ISGylation and ARIH1 affected the type II IFN mediated ISGylation. In this thesis it could be demonstrated that both types of interferons are able to induce ISGylation in HeLa cells, but different E3 ligases are involved in conjugation of ISG15 to its target proteins after type I and type II IFN induction. These observations give new insights into the regulation of IFN mediated ISGylation.