La polarité consiste en la ségrégation asymétrique de protéines, lipides ou organites au sein des cellules. Les cellules épithéliales sont un exemple de cellules hautement polarisées, avec un pôle apical, orienté vers l’extérieur, et un pôle basolatéral, orienté vers les tissus sous-jacents. Ces deux domaines sont séparés par des jonctions empêchant le passage des protéines d’un domaine à l’autre de la membrane. Par ailleurs, ces cellules organisent une polarité planaire in vivo, cruciale pour permettre différents processus morphogénétiques. La mise en place d’une telle organisation requiert la présence d’un trafic polarisé au sein des cellules pour adresser les différentes protéines au domaine adéquat de la membrane. Au cours de ma thèse j'ai étudié les mécanismes mis en place par le trafic intracellulaire pour permettre une telle organisation, avec pour modèle l’épiderme latéral du nématode Caenorhabditis elegans. D’une part, mes travaux de thèse ont mis en évidence dans les larves de nouveaux mécanismes de tri apico-basal d’une protéine essentielle pour la cohésion des tissus, la E-cadhérine. Ainsi, une première voie de tri impliquant le complexe adaptateur pour la clathrine AP-1, son interacteur physique SOAP-1 et la clathrine a été caractérisée. Un rôle pour la petite GTPase RAB-1 a également été mis en lumière dans ce processus. D’autre part, mes travaux ont mis en évidence un rôle pour cette petite GTPase RAB-1 dans l’organisation de la polarité planaire des cellules de l’épiderme au cours de la morphogenèse dans l’embryon. En effet, RAB-1 est requise pour localiser les protéines PAR spécifiquement au niveau des jonctions antéro-postérieures entre deux cellules et orienter le cytosquelette d’actine de manière perpendiculaire à l’axe antéro-postérieur. RAB-1 pourrait agir dans ce processus à trois niveaux : avec les protéines de polarité planaire Frizzled/MOM-5 et Dishevelled/DSH-2, via les phosphoinositides contrôlés par RAB-35 et OCLR-1 et/ou en régulant la tension générée à l'échelle du tissu. / Polarity is defined by the asymmetric segregation of proteins, lipids or organelles inside cells. Epithelial cells are highly polarized with an apical domain, facing the outside of the organism, and a basolateral domain facing the underlying tissues. These domains are separated by junctions to prevent diffusion between the two membrane domains. Moreover, these cells are planar polarized, a crucial process to ensure correct morphogenesis. Such an organization requires polarized membrane traffic in order to ensure proper targeting of proteins to the right domain of the plasma membrane. During my PhD, I studied the impact of membrane traffic on epithelial cell polarity by focusing on the lateral epidermis in the nematode Caenorhabditis elegans. On the one hand, my work revealed new mechanisms involved in apico-basal sorting of E-cadherin, an essential adhesion protein, in larvae. A sorting pathway involving the clathrin adaptor AP-1, its physical interactor SOAP-1 as well as clathrin has been shown to be essential for a proper apical localization of E-cadherin. Similarly, the small GTPase RAB-1 is also crucial for that process. On the other hand, my work revealed a function for RAB-1 in the planar polarity of epidermal cells during embryonic morphogenesis. RAB-1 is required to properly localize PAR proteins at antero-posterior junctions as well as to polarize actin fibers perpendicularly to the antero-posterior axis in epidermal cells. This function of RAB-1 could be linked to three pathways: the classical planar cell polarity proteins Frizzled/MOM-5 and Dishevelled/DSH-2, the phosphoinositides controlled by RAB-35 and OCRL-1 and/or by regulating tissue-level tension.

Les bactéries sont les organismes les plus abondants dans le monde. Des études sur les bactéries peuvent être bénéfiques pour la recherche médicale, la qualité des ressources en eau et l'industrie alimentaire. La détection et le marquage fluorescent est une des méthodes les plus utilisées pour des objectifs bioanalytiques. Dans la recherche de marqueurs luminescents et stables, des nouvelles nanoparticules fluorescentes et auto-stabilisées à base de polymères (FNPs, 60 nm) et des chaînes de polymères fluorescents (FPCs, 5nm) ont été développées. Dans un premier chapitre, une méthodologie pour insérer ces FNPs dans la bactérie E.coli a été développée. Pour contrôler si les FNPs sont en effet internalisé, nous avons développé un protocole basé sur l'extinction de luminescence des FNPs par le bleu de méthylène. Dans un second chapitre, les biotines conjuguées de FNPs peuvent être utilisées pour étudier les protéines membranaires spécifiques. En utilisant un lien streptavidine-biotine, un "sandwich" est formé pour construire un pont entre des particules, des anticorps spécifiques et des bactéries. Les images de fluorescence SPR et les images SEM ont démontré l'interaction de la biotine conjuguée de FNPs avec la bactérie E.coli. Dans un troisième chapitre, les chaînes de polymères fluorescents de couleur verte (GFPCs) peuvent facilement entrer dans des bactéries E.coli. Les GFPCs peuvent marquer le cyctoplasme mais pas l'ADN. Les chaînes de polymères fluorescents de couleur rouge (RFPCs) peuvent marquer facilement et efficacement la membrane de bactérie E.coli. Les deux FPCs sont extrêmement brillantes et non toxiques, les chaînes sont solubles dans l'eau. Ce sont de nouveaux matériaux fluorescents pour le marquage interne et externe des bactéries. Dans le dernier chapitre, il est démontré que les FANPs sont sensibles au pH et peuvent être utilisées pour mesurer la croissance de la bactérie E.coli. Les nano-objets détectent rapidement et précisément la croissance des cellules. En effet, leur fluorescence est sensible au changement de pH résultant du métabolisme cellulaire. De plus, ces particules permettent une surveillance en continu d'un grand nombre d'échantillons pour des applications de criblage à haut débit. Les nanomatériaux présentés dans ce manuscrit sont des outils prometteurs pour les applications en biocapteurs et bioimagerie en raison de leur luminosité/brillance et photostabilité élevées ainsi que les possibilités de post-fonctionnalisation. / Bacteria are the most abundant organisms in the world. Investigations and studies on bacteria can be beneficial to medical research, water resources research and food industry. Fluorescent sensing and labeling are commonly used for bioanalytical purposes. In the quest for very bright and stable labels, novel polymer-based, self-stabilized, fluorescent nanoparticles (FNPs, 60 nm) and fluorescent polymer chains (FPCs, 5 nm) have been developed. In the first part, a methodology to insert these FNPs into E.coli bacteria was developed. To control if the FNPs are indeed internalized, we developed a protocol based upon FNPs luminescence quenching by methylene blue. In the second part, a "sandwich" system is built. By using a streptavidin-biotin link, a bridge between particles (FNP), specific antibodies and bacteria is built. SPR, fluorescent images and SEM images demonstrated the interaction of biotin conjugated FNPs with E.coli bacteria. In the third part, interactions of fluorescent polymer chains with bacteria are investigated. Green fluorescent polymer chains (GFPCs) can easily enter into E.coli bacteria. GFPCs can label the cytoplasm but not the DNA. Red fluorescent polymer chains (RFPCs) can label the membrane of E.coli bacteria easily and efficiently. Both FPCs are highly water-soluble, bright and non-toxic, they are novel fluorescent labels for internal and external biological labeling of bacteria. In the last part, it is demonstrated that pH sensitive FANPs can be used to measure the growth of E.coli. They detect rapidly and accurately bacterial growth by signaling the change of pH resulting from cellular metabolism. Moreover, these particles allow for continuous monitoring a large number of samples for high-throughput screening applications. The studied fluorescent nanomaterials are promising tools for biosensing and bioimaging applications due to their brightness, high photostability and rich functionalisation ability.

Thèse de doctorat : Sciences du Vivant : Strasbourg 1 : 2007. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. p. 165-175.

Les nanoparticules de silice mésoporeuses (MSNs) sont utilisées de plus en plus pour des applications d’imagerie médicale et d’élution de médicament. Bien qu’elles ne soient pas encore approuvées pour la clinique, ces produits font actuellement l’objet de plusieurs études précliniques. En particulier, notre groupe de recherche a démontré que les nanoparticules de silice poreuses marquées d’éléments paramagnétiques sont des agents de contraste efficaces en imagerie par résonance magnétique (IRM). La porosité ouverte de ces produits offre des pistes intéressantes pour des applications de livraison de médicament sous imagerie médicale. Ce projet de maîtrise porte plus particulièrement sur la préparation des particules de silice mésoporeuses marquées d’éléments paramagnétiques, en vue d’applications en imagerie cellulaire, et en imagerie vasculaire. Dans un premier temps, la possibilité de marquer des particules de silice au moyen d’un élément paramagnétique (Mn) a été démontrée. Ces produits ont fait l’objet d’une étude de caractérisation physico-chimique, et d’une étude de marquage cellulaire. Il a été démontré que les nanoparticules Mn-MSNs internalisées dans des cellules leucémiques de souris sont visibles en IRM. Or, avant traitement des cellules, tout comme pour la préparation d’une suspension de MSNs pour une injection intravasculaire, il est nécessaire de purifier les nanoparticules de la présence d’ions métalliques potentiellement toxiques (Gd3+, Mn2+, utilisés pour le marquage des nanoparticules et la visibilité en IRM). Afin de faciliter la purification des nanoparticules par une technique rapide, une méthode de chromatographie par exclusion stérique a été développée, optimisée et appliquée à une procédure de marquage de MSNs au moyen d’ions paramagnétiques (Gd3+) et radioactifs (64Cu2+). Le développement de cette technique a été essentiel pour purifier les MSNs, qui ont ensuite été injectées dans des souris, et visualisées en IRM et en tomographie par émission de positons (TEP). Ces études ont permis de mesurer la biodistribution des particules de MSNs sur 48 h. Ce projet a également permis de démontrer que les biodistribution dynamiques sous TEP permettront de mieux comprendre la biodistribution, la rétention aux organes, et l’excrétion des nanoparticules de MSNs développées comme potentiel agent de vectorisation de médicaments. / Mesoporous silica nanoparticles (MSNs) are increasingly used in medical imaging and drug delivery applications. They are still not approved for the clinic; however, these products have been used in several preclinical studies, and are being evaluated for clinical trials. Our group demonstrated that MSNs labeled with paramagnetic elements are efficient as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). The open porosity of these products leads to interesting applications for drug delivery under medical imaging. This master’s degree project has focused on the preparation of MSNs labeled with paramagnetic elements, for applications in cellular imaging, and vascular imaging. First, MSNs labeled with paramagnetic element (Mn) were used to label and to visualize cells in MRI. These products were subjected to a physico-chemical characterization study, and a cellular labelling study. It was demonstrated that Mn-MSNs nanoparticles internalized in leukaemia mouse cells are visible using MRI. However, before cells treatment, just like for the preparation of MSNs suspension for intravascular injection, it is necessary to purify nanoparticles from the potentially toxic paramagnetic metal ions (Gd3+, Mn2+). To facilitate and accelerate the purification time, a size exclusion chromatography method was developed, optimized and applied to MSNs labelled with paramagnetic (Gd3+) and radioactive (64Cu2+) ions. The development of this technique was essential to purify MSNs from both Gd3+ and 64Cu2+, which were then injected in mice, and visualized with MRI and positron emission tomography (PET). These studies have made it possible to measure the biodistribution of MSN over 48 h in the mouse model. PET dynamic biodistributions studies allow a better understanding of biodistribution, organ retention, and excretion of MSNs nanoparticles developed as potential drug vectors.

Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / Les copépodes dominent la biomasse du mésozooplancton des régions arctiques et subarctiques, où lumière, glace et production primaire varient fortement selon les saisons. En transformant le carbone fixé par les microalgues en réserves lipidiques pour survivre l'hiver, les Calanus spp. constituent une source d'énergie cruciale pour les poissons, oiseaux et mammifères marins. Historiquement, les copépodes sont étudiés par un comptage taxonomique après un échantillonnage par filets. Cette thèse propose un autre paradigme en combinant l'utilisation d'outils d'imagerie plus récents et une approche dite « par traits fonctionnels ». Les traits fonctionnels sont des propriétés mesurables à l'échelle individuelle et influençant le succès écologique des organismes (i.e. taille, régime trophique, migration verticale). Ils sont partagés par plusieurs espèces et peuvent être reliés à des fonctionnalités des écosystèmes comme l'export de carbone ou l'énergie disponible pour les réseaux trophiques par exemple. Comme une majorité des traits possèdent une signature morphologique, nous les avons définis sur deux types d'images individuelles du plancton, complémentaires et couramment utilisées : des images in situ de l'Underwater Vision Profiler (UVP) et des images en couleur prises lors d'observations au stéréomicroscope. L'objectif de cette thèse est de comprendre comment les traits fonctionnels des copépodes, identifiés sur des images, peuvent être reliés aux dynamiques environnementales et au fonctionnement des écosystèmes arctiques et subarctiques. Dans le Chapitre 1, nous analysons des images in situ prises par l'UVP au moment de la fonte printanière de la banquise dans l'arctique canadien. Des variables morphologiques sont utilisées pour projeter les images dans un espace statistique, et les axes synthétisent les variations morphologiques en trois traits continus : la taille, l'opacité (qui nous renseigne sur les structures pigmentées), et la complexité du contour (indiquant probablement un taux d'activité par la visibilité des appendices). Cette analyse exploratoire a révélé des traits nouveaux, dont les variations étaient fortement corrélées à la fonte de la banquise et à l'efflorescence des algues. Plusieurs arguments indiquent que les maxima d'opacité des individus peuvent être attribués à la présence d'astaxanthine, un pigment caroténoïde rouge. Dans le Chapitre 2, une revue de la littérature a mis en évidence les conditions écologiques propices à la coloration des copépodes pour divers écosystèmes aquatiques à l'échelle globale. Nous démontrons que la pigmentation rouge peut participer au succès des individus (croissance, survie, reproduction) grâce aux propriétés antioxydantes de l'astaxanthine. Comme la pigmentation semble ajustable à de courtes échelles temporelles et avantageuse dans diverses conditions environnementales (lumière intense, basses températures et couvert de glace, ou grandes profondeurs), nous pensons qu'elle peut être considéré comme un de "couteau-suisse" de protection métabolique. Dans le Chapitre 3, une méthode de déconvolution de la couleur de l'astaxanthine a été utilisée pour produire un indice de rougeur sur des images de copépodes arctiques observés au stéréomicroscope. L'indice a été validé par comparaison avec une quantification chimique des pigments, et peut être utilisé pour des images prises dans diverses conditions grâce à une étape préalable de calibration des canaux de couleur. Cette thèse montre qu'il est possible d'extraire un maximum d'information à partir d'une image de plancton pour dégager des tendances écologiques sur de grands jeux de données, tout en gardant accès à la variabilité interindividuelle. Utiliser les traits définis ici (taille, pression de broutage, taux d'antioxydants), en combinaison avec d'autres outils, pourrait participer à la compréhension du fonctionnement des réseaux trophiques. / Copepods dominate the mesozooplankton biomass of arctic and sub-arctic regions, where light, ice and primary production are highly variable according to the season. By converting carbon fixed by microalgae into lipid reserves for winter survival, Calanus spp. are a crucial source of energy for fish, birds and marine mammals. Historically, copepods have been studied by taxonomic counting after net sampling. This thesis proposes an alternative paradigm by combining the use of more recent imaging tools and functional trait-based approach. Functional traits are properties that are measurable at the individual scale and influence the ecological success of organisms (i.e. size, trophic regime, vertical migration). They are shared by several species and can be related to ecosystem functionalities such as carbon export or energy available for food webs for example. As a majority of them have a morphological signature, we defined them on two types of individual plankton images, complementary and commonly used: in situ images from the Underwater Vision Profiler (UVP) and color images taken during stereomicroscope observations. The objective of this thesis is to understand how functional traits of copepods, identified in images, can be related to environmental dynamics and functioning of arctic and sub-arctic ecosystems. In Chapter 1, we analyze in situ images taken by the UVP at the time of spring melt in the Canadian arctic. Morphological variables are used to project the images into a statistical space, and the axes synthesize morphological variation into three continuous features: size, opacity (which tells us about pigmented structures), and complexity of contour (likely indicating feeding activity through appendage visibility). This exploratory analysis revealed novel traits, having variations strongly correlated with sea ice melt and algal blooms phenology. Several arguments indicate that opacity maxima in individuals can be attributed to the presence of astaxanthin, a red carotenoid pigment. In Chapter 2, a review of the literature highlighted the ecological conditions conducive to copepod coloration for various aquatic ecosystems on a global scale. We demonstrate that red pigmentation can participate in the success of individuals (growth, survival, reproduction) through the antioxidant properties of astaxanthin. Since pigmentation appears to be adjustable on short time scales and advantageous under various environmental conditions (intense light, low temperatures and ice cover, or great depths), we believe it can be considered as a "swiss army knife" of metabolic protection. In Chapter 3, an astaxanthin color deconvolution method was used to produce a redness index on stereomicroscope images of arctic copepods. The index was validated by comparison with a chemical quantification of the pigments, and can be used for images taken under various conditions thanks to a prior calibration step of the color channels. This thesis shows that it is possible to extract a maximum amount of information from a plankton image to identify ecological trends on large datasets, while keeping access to inter-individual variability. Using the traits defined here (size, grazing pressure, antioxidant levels), in combination with other tools, could participate in understanding the functioning of food webs.