Ziel der vorliegenden Arbeit war anhand eines Tiermodells zu untersuchen, 1. ob eine Dosis-Wirkungsbeziehung zwischen der Keimmenge und der Entstehung einer oralen C. albicans Infektion besteht, 2. welche zelluläre Immunantwort auf definierte inokulierte Keimmengen stattfindet, 3. ob sich die Adhärenz von C. albicans an murine Epithelzellen durch Spaltprodukte von Muzin (Glykopeptide) verhindern läßt. Material und Methode: Immunkompetente Inzuchtmäuse (Balb/c) (n=27) und Mäuse mit kombiniertem B- und T-Zelldefekt (SCID) (n=30) wurden mit Keimmengen von10^4 bis 10^8 C. albicans-Zellen/10 mikrol des Stammes DSM 3454 oral inokuliert. Darüber hinaus wurden Balb/c Mäuse (n=8) mit 10^8 C. albicans-Zellen in Kombination mit Glykopeptiden und SCID Mäuse (n=8) mit 10^5 C. albicans-Zellen mit Glykopeptiden inokuliert. Eine Zungenhälfte wurde histologisch mittels Periodic-Acid-Schiff (PAS) Reaktion auf Invasion von Hyphen untersucht. Die andere Hälfte wurde mittels Immunperoxidase-Technik auf die Verteilung immunkompetenter Zellen (CD4, CD13, ICAM-1, E-Selectin, CD74, CD80, CD86, CD103) im Epithel und subepithelialen Bindegewebe untersucht. Ergebnisse: Eine Woche post inoculationem fanden sich weder bei Balb/c noch bei SCID Mäusen klinische Zeichen einer oralen Candidiasis. Die histologischen Ergebnisse mittels PAS-Methode zeigten jedoch, daß eine Inokulationsmenge von 10^8 C. albicans-Zellen bei Balb/c Mäusen und 10^8 Keime bei SCID Mäusen zu einer Infektion der Zungenmukosa führte. Das Ausmaß der immunologischen Reaktion war abhängig von der Inokulationsdosis sowie vom Immunstatus der Tiere. Die Ergebnisse der Inokulation von 10^8 C. albicans-Zellen zusammen mit Glykopeptiden zeigten bei 2/8 Balb/c Mäusen eine Hypheninvasion in das Zungenepithel. Bei 0/8 SCID Mäusen wurde nach Inokulation von 10^4 C. albicans-Zellen zusammen mit Glykopeptiden eine Hypheninvasion in das Zungenepithel beobachtet. Die immunhistochemischen Ergebnisse zeigten, daß die Reaktionen des Wirtes auf die Gabe der Keim-Glykopeptidlösung denen ohne Inokulation entsprachen. Schlußfolgerung: Obwohl bei den eingesetzten C. albicans-Mengen keine klinisch manifeste orale Candidiasis vorhanden war, fanden sich in beiden Tierstämmen inapparente Infektionen des Zungenepithel (Hypheninvasion), die immunologische Reaktionen der Zungenmukosa auslösten. Da nach Inokulation von C. albicans-Zellen zusammen mit Glykopeptiden weniger häufig Infektionen nachgewiesen werden konnten als bei Inokulation derselben Keimmenge ohne Glykopeptide und Nebenwirkungen dieser antiadhäsiven Wirkstoffe bisher nicht nachgewiesen wurden, wäre der unterstützende Einsatz von Muzinen oder deren Spaltprodukten bei Patienten mit erhöhtem Candidiasisrisiko zu erwägen. / This study applied an animal model to address the following questions: 1. Does a dose/effect relationship exist between C. albicans load and the emergence of an oral C. albicans infection, 2. which cellular immune response takes place following inoculation with defined pathogen loads, 3. is it possible to inhibit C. albicans adhesion to murine epithelium cells through the local application of mucine metabolites (glycopeptides). Material and methods: Immunocompetent inbred mice (Balb/c) (n=27) and mice with combined B- and T-cell defects (SCID) (n=30) were orally inoculated with pathogen loads between 10^4 and 10^8 C. albicans cells/10 microl (strain DSM 3454). Moreover, Balb/c mice (n=8) were inoculated with 10^8 C. albicans cells in combination with glycopeptides; SCID mice (n=8) were inoculated with 10^5 cells, also in combination with glycopeptides. One half of the tongue tissue was histochemically examined with the Periodic Acid Schiff (PAS) Method for displaying the invasion of hyphae. The other half of the tissue was examined by immune peroxidase technique for analysing the distribution of immunocompetent cells (CD4, CD13, ICAM-1, E-Selectin, CD74, CD80, CD86, CD103) in the epithelial layers and subepithelial connective tissue. Results: One week following the inoculation, neither group's tissue showed clinical signs of oral candidiasis. Following histochemical preparation (PAS-Reaction) the tongue mucosa showed signs of infection (hyphae) with the inoculation dose of 10^8 C. albicans cells in the case of Balb/c mice and a load of 10^5 pathogens in the case of SCID mice. The extent of the immunologic reaction depended both on the inoculation dose given to the animals and on their immune status. The results of an inoculation of 10^8 C. albicans cells in combination with glycopeptides showed hyphae invasion of the tongue epithelium in 2/8 Balb/c mice. Following an inoculation of 10^5 pathogens in combination with glycopeptides hyphae invasion could be demonstrated in 0/8 SCID mice. The results of immunohistochemical studies showed that the host's reaction to combined glycopeptide-pathogen-inoculation correspond to the reaction without inoculation. Conclusion: Despite the lack of clinical signs of oral candidiasis in neither group's tissue, non-apparent infections of the tongue epithelium were evident leading to immunologic reactions of the tongue mucosa. Inoculation of C. albicans cells in combination with glycopeptides resulted in decreased infection rate compared to a corresponding inoculation dose without glycopeptides. As no side effects have been documented for the oral application of these antiadhesive agents, their use as complimentary therapy for patients at an increased risk for oral candidiasis should be considered.

In den vergangenen Jahren sind Lipide, Membranen und deren Organisationsformen mehr und mehr in den Fokus der biologischen Forschung gerückt. Es wurde vorgeschlagen, dass in zellulären Membranen selbstassemblierende, submikroskopische Aggregate aus Sphingolipiden, Cholesterol und bestimmten Proteinen existieren und man vermutet, dass insbesondere Viren diese “Lipid Rafts” für ihren Zusammenbau nutzen und auf diese Art ihre Proliferationseffizienz erhöhen. Gleichwohl sind die genaue biologische Funktion und auch die molekulare Basis der Assoziation bestimmter Protein mit Lipid Rafts auch weiterhin unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde Fluoreszenz-Lebenszeit-Mikroskopie genutzt, um die Lipid-Raft-Anreicherung des HIV-1 Glycoproteins gp41 zu untersuchen. Förster-Resonanz-Energietransfer zwischen fluoreszenzmarkierten viralen und Raft-Marker-Proteinen wurde gemessen, um deren gemeinsame, lokale Aufkonzentrierung in Lipid Rafts nachzuweisen. Durch Verwendung verschiedener Deletions- und Mutationsvarianten des Proteins konnte nicht nur seine Lipid-Raft-Präferenz demonstriert, sondern auch das Cholesterol-Bindemotiv (CRAC) als entscheidender Faktor der lateralen Sortierung identifiziert werden. Wir haben in diesem Kontext auch eine systematische Zell-zu-Zell-Variabilität in unseren Daten bemerkt, die einen zugrundeliegenden zellbiologischen Mechanismus der Membranorganisation nahelegt. Mithilfe von Fluoreszenz-Polarisations-Mikroskopie konnte zudem eine klare CRAC-Abhängigkeit der gp41-Oligomerisierung aufgezeigt werden. Die von uns gewonnenen Daten erlauben einen tieferen Einblick in die molekulare Basis und die biologischen Folgen der cholesterol-abhängigen lateralen Proteinorganisation für Virusassemblierungsprozesse an biologischen Membranen. / In recent years, there has been a considerable interest in the molecular organization of biological membranes. It has been hypothesized that self-assembling, freely diffusing, submicroscopic domains consisting of sphingolipids, cholesterol and certain proteins exist and the prevailing view is that those lipid rafts serve as platforms for specific molecular interactions by the preferential exclusion and inclusion of proteins. It was presumed, that in particular viruses make use of plasma membrane lipid rafts to augment the infection process and spread efficiently. However, the exact biological function and physical basis of protein partitioning into microdomains remains an outstanding question in virus biology. In the present study, fluorescence lifetime imaging microscopy was used to study lipid raft partitioning of the HIV-1 glycoprotein gp41 by detecting Foerster Resonance Energy Transfer between fluorescently labeled viral and raft marker proteins in living cells. Plasma membrane microdomain association of gp41 was demonstrated and by introducing systematic mutations and truncations in different gp41 motifs, the cholesterol recognition amino acid consensus (CRAC) was identified as the crucial determinant of the lateral sorting. Interestingly, we observed a systematic cell-to-cell variability in our raft related data that suggests underlying cell-biological mechanisms of membrane organization. Moreover, fluorescence polarization microscopy revealed a distinct CRAC requirement for gp41 oligomerization whereas other properties, such as intracellular distribution and expression efficiency were clearly demonstrated to be CRAC independent. Our data provide further insight into the molecular basis and biological implications of the cholesterol dependent lateral protein sorting for virus assembly processes at cellular plasma membranes.

Ein neuartiger Ansatz für die Immunphänotypisierung wird vorgestellt. Die Durchflusszytometrie (FACS) ist die übliche Methode für die Charaketrisierung des Immunsystems. Jedoch ist die Verfügbarkeit von frischem Vollblut, sowie ein schnelle Probenlogistik Vorraussetzung für die Analyse. Als potentialle Alternative werden epigentische qPCR Assays vorgestellt. Für die Quantifizierung von B- und NK-Zellen wurden epigenetische qPCR Systeme etabliert. Anhand eines erweiterten epigenetischen Markerpanels wurde die klinische Anwendung in drei Kohorten getestet: a) 41 Patienten mit primären Immundefizienzen (PID); b) 19 Neugeborene mit und ohne PID und c) 28 Patienten nach einer Stammzelltransplantation (SZT). In Kohorte a) und c) konnte die Äquivalenz der Ergebnisse mit FACS bestätigt werden. Diskrepanzen bei der regulatorischen T-Zell Quantifizierung in einzelnen PID Patienten wurde festgestellt, welche durch Mutationen verursacht wurden, die die Integrität der analysierten Proteine beeinflussen. Zudem konnte die Anwendung der epigentischen Quantifizierung in Trockenblutkarten von Neugeborenen gezeigt werden. Dies würde die Anwendung auch im Neugeborenen-Screening für die Erkennung von PIDs ermöglichen. Für die Anwendung in der SZT konnte gezeigt werden, dass das epigenetische System eine frühe Analyse der Immunrekonstitution ermöglicht, welche eine prädiktive Aussage über das Überleben der Patienten erlaubt. Patienten, welche eine Immunantwort der Lymphozyten gegen eine Virusinfektion bereits am Tag 26 nach Transplantation aufwiesen, hatten eine signifikant höhere Überlebenschance als Patienten ohne Immunantwort. Zusammengefassend zeigen die Daten, dass die epigenetische Systeme für klinische Anwendungen eine zuverlässige Methode darstellt. Die Aussagekraft der Daten ist aufgrund der Studiengröße noch limitiert, und komplizierte klinische Szenarien erschweren die Evaluierung. Deshalb sind weitere Studien erforderlich, um das gezeigte Potenzial zu validieren. / A novel approach for immunophenotyping for clinical applications is presented here. Flow cytometry is currently a common method to characterize the immune system but requiring fresh whole blood and good sample logistics which is not always available. To overcome this limitations, epigenetic qPCR assays are introduced as potential alternative. New epigenetic qPCR systems to quantiy B and NK cells have been established. Using an extended epigenetic marker panel, clinical applications were tested in three patient cohorts: a) 41 patients with different primary immunodeficiencies (PID); b) 19 newborns with and without PID and c) 28 patients after stem cell transplantation (SCT). In cohort a) and c) the equivalence of the epigenetic quantification with flow cytometry was confirmed. However, discrepancies between both methods for regulatory T-cell quantification were found in individual PID patients caused by disease-associated mutations affecting the integrity of the respective protein. Furthermore, the epigenetic quantification using dried blood spots from newborns was demonstrated. This would allow the implementation of epigenetic immunophenotyping in neonatal screening for the detection of congenital immunodeficiencies. For the application in SCT, it was shown that the epigenetic system allows an early analysis of immune reconstitution, which may allow a prediction of the patients' overall survival. Patients who showed an immune response of lymphocytes against viral infections at day 26 after transplantation had a significantly higher survival rate. In summary, the available data show that epigenetic immunophenotyping is a reliable analytical method for various clinical applications. The significance of the data is still limited due to the size of the study and complicated clinical scenarios make the evaluation of individual measurements difficult. Therefore, further extensive investigations are needed to clinically validate the demonstrated potential.