Mémoire de DES : Biologie médicale : Université de Nantes : 2004. Thèse d'exercice : Pharmacie : Université de Nantes : 2004. / Bibliogr. f. 170-178.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 18 janvier 2005). Bibliogr.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / En liant la portion constante des IgGs, les récepteurs Fcy (FcyRs) participent à l'ingestion des pathogènes opsonisés et des complexes immuns. La régulation fine de cette fonction est requise pour éviter le développement de pathologies autoimmunitaires. Le neutrophile humain est un phagocyte particulier puisqu'il exprime constitutivement deux isoformes activateurs (FcyRIIa et FcyRIIIb), sans toutefois posséder l'isoforme inhibiteur (FcyRIIb). Cette particularité est à l'origine des deux projets présentés dans cette thèse. D'une part, nos travaux ont étudié la coordination des signaux entre les deux isoformes lors de la stimulation du neutrophile humain avec du zymosan opsonisé par des IgGs et avec des complexes d'IgGs aggrégées (HA-IgG). D'abord, une forte interdépendance entre les deux isoformes nécessaire aux fonctions de phagocytose et de production d'anion superoxyde ainsi que pour la génération du profil de phosphorylation sur résidus tyrosine a été observée. Cependant, un influx de calcium extracellulaire essentiel à la phagocytose a été attribué à l'engagement spécifique du FcyRIIIb. Ce rôle exclusif du FcyRIIIb s'avère dépendant de l'intégrité des domaines membranaires résistants aux détergents (DRMs) dans lesquels les deux isoformes sont co-recrutés à la suite de leur engagement. D'autre part, un nouveau mode de régulation de l'activation des FcyRs a été décrit, indépendant de l'inhibition par le FcyRIIb. Par l'entremise de l'ubiquitine-ligase c-Cbl, le FcyRIIa est poly-ubiquitinylé puis dégradé par le protéasome. Ce processus de régulation est contrôlé positivement par la protéine adaptatrice CIN85 de manière dépendante des PKCs classiques. Cette voie s'avère également dépendante de l'intégrité des DRMs, plateforme de colocalisation entre le FcyRIIa, c-Cbl et CTN85. En conclusion, ces travaux ont permis de comprendre la signification biologique de l'expression combinée du FcyRIIa et du FcyRIIIb et l'interdépendance entre ces deux isoformes, tant du point de vue de la signalisation intracellulaire que des fonctions qui en découlent. De plus, un nouveau mode de régulation est proposé pour pallier à l'absence de l'isoforme FcyRIIb sur le neutrophile humain et ainsi éviter l'activation exacerbée des fonctions du neutrophile humain dépendantes de l'engagement des FcyRs.

L'asthme est une pathologie inflammatoire de type TH2 caractérisée par une éosinophilie sanguine et bronchique, toutefois le rôle précis de l'éosinophile reste à définir. Premièrement, nous avons démontré que les éosinophiles sanguins expriment de façon transitoire le Fc?RIII (CD16), un récepteur d'IgG, lors de la crise asthmatique. Nous avons observé que l'IL-2 et les complexes immuns IgG favorisent l'expression de surface du CD16. Nous avons également trouvé que le rapport des IgG spécifiques pour les allergènes sur les IgE totaux corrèle avec l'expression du CD16 lors d'une crise d'asthme et que les éosinophiles sanguins CD16+ présentent un plus faible niveau d'IL-12 intracellulaire. Finalement, nous avons démontré que lL-12 est une cytokine régulatrice pour l'éosinophile, elle réduit sa capacité de migration et de dégranulation mais n'affecte pas sa viabilité. Ces études démontrent que des facteurs normalement associés à la réponse de type TH1 jouent un rôle dans l'activité biologique de l'éosinophile dans un contexte d'asthme.

Titre de l'écran-titre (visionné le 18 mars 2024) / L'infiltration de lymphocytes B (LB) dans les tissus adipeux entraine un dysfonctionnement du métabolisme énergétique dans un contexte d'obésité et de vieillissement en produisant des immunoglobulines G du sous-type 2c (IgG2c). Ces immunoglobulines sont considérées comme auto-immunes et leur production dépend en partie de l'activation du récepteur des lymphocytes B (BCR) et d'un récepteur Toll-Like (TLR) intracellulaire. En revanche, les voies métaboliques modulatrices de la production des IgG2c ne sont pas bien connues. Les présents travaux avaient pour but de mettre au point un système de culture *in vitro* de LB et une méthode de mesure quantitative de la production des IgG2c afin d'élucider des voies métaboliques potentielles. La mise au point du cocktail d'activation a été validée après avoir testé différentes combinaisons de molécules pouvant entrainer une augmentation d'expression d'IgG2c. Des LB de souris mâles et femelles, d'âges différents, ont été isolés par une méthode de sélection négative. À la suite des traitements avec différents cocktails d'activation, pendant 1, 3 ou 7 jours, l'expression des IgG2c a été mesurée par cytométrie en flux. Cette méthode a permis d'étudier de manière quantitative l'activation et de déterminer le temps d'activation optimal (3 jours) pour l'étude de l'expression des IgG2c. Nous avons déterminé que les meilleures conditions d'activation des LB pouvant stimuler la production d'IgG2c impliquaient la présence d'un activateur de BCR et du TLR9. L'âge et le sexe n'ont pas eu d'impact sur la production d'IgG2c dans ce modèle de culture cellulaire. Ceci suggère que les changements de production d'IgG2c pendant le vieillissement ne proviennent pas d'un dysfonctionnement interne des LB, mais de facteurs externes. Finalement, dans ces conditions d'analyses, la leptine semble freiner la production des IgG2c. Afin de mieux comprendre cette modulation et si cette dernière est affectée lors du vieillissement, d'autres études seront nécessaires. / B-cell infiltration in adipose tissue leads to dysfunctional energy metabolism in the context of obesity and aging by producing immunoglobulins G subtype 2c (IgG2c). These immunoglobulins are auto immune and their production depends on the activation of B-Cell Receptor (BCR) and intracellular Toll-Like Receptor (TLR) (TLR7 or TLR9). However, the specific metabolic pathways involved in modulating IgG2c production are not well known. The aim of the present work was to develop an *in vitro* B-cell culture system and a method for quantitative measurement of IgG2c production, as well as the determination of the metabolic pathways involved in modulating this production. Activation cocktails were optimized after testing different combinations of molecules that could induce IgG2c production. Primary B cells from male and female mice of different ages were isolated by negative selection. Cells were then seeded on non-adherent plates. After activation during 1, 3 or 7 days with different activation cocktails, IgG2c expression was measured by quantitative flow cytometry. In this setting, the optimal incubation time for the study of IgG2c production was 3 days. IgG2c production was significantly higher in the presence of BCR and TLR9 activators. Age and sex did not change IgG2c production. These results suggests that modulation in IgG2c production in aging does not result from an intracellular B cell dysfunction but is rather due to changes in external factors. Finally, preliminary results point to leptin as potential inhibitor of IgG2c production. In order to better understand this modulation, further studies are needed.

Depuis leur découverte en 1975 par Köhler et Milstein, le monde des Ac monoclonaux a beaucoup évolué. Ils occupent actuellement une place prépondérante dans la prise en charge de nombreux cancers. De nos jours, les Ac monoclonaux, ayant une AMM ou en essai clinique, sont tous de classe IgG voire IgG1. Cette classe d’Ac a cependant montré des limites à son utilisation, et l’étude d’autres isotypes d’Ac, comme les IgA, pourrait être intéressante. Les IgA, isotype d’Ac particulier en raison notamment de leur hétérogénéité dans les formes moléculaires, demeurent peu étudiées à l’instar des IgG. Dans ce travail, nous proposons un radiomarquage des IgA monomériques, polymériques et sécrétoires, avec le 99mTc par une méthode indirecte impliquant le 2-iminothiolane et le cœur tricarbonyl. Par le biais de ce radiomarquage, la biodistribution des IgA monomériques et polymériques après administration i.v. a été évaluée chez l’animal sain et chez l’animal porteur de tumeur à localisation muqueuse. Ces études nous ont permis d’entrevoir le potentiel diagnostique des IgA, mais aussi leur intérêt en thérapie ciblée de tumeurs à localisation muqueuse. D’autre part, grâce à leur résistance enzymatique et au phénomène de retranscytose, une nouvelle voie d’administration des Ac monoclonaux pourrait être développée. Dans cette optique, des IgA sécrétoires ont été administrées par voie orale lors d’études préliminaires de biodistribution. / Since their discovery in 1975, by Köhler and Milstein, monoclonal antibodies (mAbs) world has significantly evolved and they currently hold a prominent place in cancers care. Today, the mAbs, having a marketing authorization or in clinical trial, are all IgG class (IgG1). However, this Ab class showed limitations on its use, and the study of other isotypes, such as IgA, could be interesting. Unlike IgG, IgA, original isotype particularly because of their heterogeneity in molecular forms, remains understudied. In this work, we propose a radiolabeling of monomeric, polymeric and secretory IgA with 99mTc by an indirect method, involving 2-iminothiolane and tricarbonyl core. Biodistribution of radiolabeled monomeric and polymeric IgA was evaluated, after intravenous administration, in healthy animals and in mucosal tumor-bearing animals. These studies have allowed us to glimpse the IgA diagnostic potential, but also their interest in targeted therapy of tumors with mucosal localization. Moreover, thanks to their enzymatic strength and retranscytosis, a new administration route of mAbs could be developed. In this context, secretory IgA were administered orally in preliminary biodistribution studies.

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2005-2006 / Le neutrophile est spécialisé dans la chimiotaxie et la phagocytose. Ces deux phénomènes sont accompagnés d'une accumulation de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate. Ce dernier est formé par les phosphatidylinositols 3-kinases. Leur activation et la formation de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate sont bien caractérisés dans le neutrophile. La régulation du niveau de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate par les lipide phosphatases est peu étudiée. Nous avons examiné le rôle des lipide phosphatases SHIP1 et PTEN suite à la stimulation du CD32a, un FcyR, dans la régulation du niveau de phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate. Ce dernier augmente suite à la stimulation du CD32a. La localisation cellulaire et la phosphorylation de SHIP1, mais pas de PTEN, sont modifiées en réponse à la stimulation du CD32a. Ces événements seraient dépendants des Src kinases. Par contre, ils seraient indépendants de l'activation des phosphatidylinositol 3-kinases. SHIP1, et non PTEN, pourrait donc être impliquée dans la régulation du phosphatidylinositol(3,4,5)triphosphate formé suite à la stimulation du CD32a dans le neutrophile humain.

La néphrite lupique est le prédicteur le plus important de mortalité dans le lupus érythémateux disséminé. Elle se caractérise par le dépôt d'auto-anticorps, essentiellement des immunoglobulines G, aux reins et à la formation de complexes immuns. Les plaquettes humaines sont activées par les complexes immuns dans le lupus via FcɣRIIA, leur unique récepteur ciblant la portion Fc des immunoglobulines G (FcɣR). Considérant l'abondance des plaquettes, FcɣRIIA est le FcɣR le plus important du sang. L'ajout de FcɣRIIA dans le modèle murin NZB/WF1 de lupus accélère le développement de la néphrite lupique. Les neutrophiles contribuent aux dommages rénaux dans la maladie. Une interaction efficace avec les plaquettes est requise en contexte inflammatoire pour permettre leur extravasation. Notre hypothèse est qu'en réponse aux complexes immuns, FcɣRIIA accélère le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins dans la néphrite lupique. Pour vérifier notre hypothèse, les deux types cellulaires ont été marqués en immunofluorescence et dénombrés aux reins de souris NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ et sauvages aux différents stades de néphrite lupique. FcɣRIIA augmente le recrutement des plaquettes, mais pas celui des neutrophiles, aux reins dans la maladie. Le recrutement des plaquettes concorde avec le développement de la néphrite lupique uniquement pour les souris FcɣRIIAᵀᴳᴺ. Aucune corrélation entre le recrutement des plaquettes et des neutrophiles aux reins n'a pu être établie. Bien qu'ils expriment le récepteur dans le sang, ces deux cellules expriment faiblement FcɣRIIA aux reins. FcɣRIIA est exprimé par des cellules AIF-1⁺F4/80⁺ aux reins pointant vers un rôle potentiel des phagocytes mononucléaires dans la pathogenèse de la néphrite lupique. En somme, ce travail a permis de faire la caractérisation spatiotemporelle de FcɣRIIA aux reins dans le modèle NZB/WF1 de lupus. Des études supplémentaires seront nécessaires pour comprendre la contribution des cellules FcɣRIIA⁺ résidentes et infiltrant le rein dans la pathogenèse de la néphrite lupique. / Lupus nephritis is the most important predictor of mortality in systemic lupus erythematosus. It is characterized by the deposition of autoantibodies, essentially immunoglobulins G, to the kidneys and the formation of immune complexes. Human platelets are activated by immune complexes in lupus through FcɣRIIA, their unique receptor targeting the Fc portion of immunoglobulins G (FcɣR). Given the abundance of platelets, FcɣRIIA is the most important FcɣR in blood. The addition of FcɣRIIA in the NZB/WF1 lupus mouse model accelerates the development of lupus nephritis. Neutrophils contribute to kidney damage in the disease. An efficient interaction with platelets is required to allow their extravasation in inflammatory contexts. We hypothesized that in response to immune complexes, FcɣRIIA accelerates the recruitment of platelets and neutrophils to kidneys in lupus nephritis. To verify our hypothesis, the two cell types were identified in immunofluorescence and counted in the kidneys of NZB/WF1.FcɣRIIAᵀᴳᴺ and wild type mice at different stages of lupus nephritis. FcɣRIIA increases the recruitment of platelets, but not neutrophils, to the kidneys in the disease. Platelet recruitment is consistent with the development of lupus nephritis only for FcɣRIIAᵀᴳᴺ mice. No correlation between the recruitment of platelets and neutrophils to the kidneys could be established. Although they express the receptor in the blood, these two cells weakly express FcɣRIIA in the kidneys. FcɣRIIA is expressed by AIF-1⁺F4/80⁺ cells in the kidneys pointing to a potential role of mononuclear phagocytes in the pathogenesis of lupus nephritis. Overall, this work has allowed to achieve the spatiotemporal characterization of FcɣRIIA in the kidneys in the NZB/WF1 lupus model. Further studies will be needed to understand the contribution of renal resident and infiltrating FcɣRIIA⁺ cells in the pathogenesis of lupus nephritis.

L’objectif de mon doctorat, réalisé dans le cadre d’une collaboration entre le laboratoire des protéines et nanotechnologies en sciences séparatives (institut Galien Paris-Sud) et le groupe Micro et Nano Système (institut d’électronique fondamentale) était d’étudier l’influence des monocouches autoassemblées, sur l’activité biologique du bio-récepteur dans une perspective de développement de biocapteur. Dans ce projet, nous avons choisi les organo-silanes qui peuvent se lier de manière covalente sur le silicium. Deux silanes (7-octenyl trichlorosilanes et le (3-aminopropyl)triethoxysilane) ont été étudiés, leur impact en terme de nature et de stabilité sur la fonctionnalité du bio-récepteur, des immunoglobulines G de souris, ont été évalué. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la fonctionnalité des anticorps greffés sur une mono couche auto-assemblée composée de 7-octenyltrichlorosilane (OTS) présentant à sa surface un groupement carboxylique. Une caractérisation spectroscopique par XPS et infra-rouge à transformé de Fourrier (FTIR) a tout d’abord été effectuée afin de vérifier la présence de ces groupements carboxyliques. L’homogénéité de la surface a été évaluée par AFM. Nous avons ensuite immobilisé ces anticorps, sur ces supports, de manière covalente et une étude topographique par AFM a été menée pour mesurer la répartition de ces anticorps. L’orientation des anticorps greffés a été évaluée à l’aide d’immuno-essais. Ensuite, nous avons comparé l’APTES, permettant l’obtention de plaques de silicium fonctionnalisé avec des groupements aminés à leur surface, avec l’OTS. Nous avons notamment comparé la capacité de capture des anticorps immobilisés sur ces deux types de silanes. Dans la dernière partie, l’impact du vieillissement d’un support immunologique préparé chimiquement en utilisant l’APTES a été évaluée sur le plan physico-chimique et biologique. / The aim of my PhD thesis, conducted as part of a collaboration between the laboratory of protein separation sciences and nanotechnology (Paris-Sud Galen Institute) and the Micro and Nano System (basic electronics institute) group was to study the influence of self-assembled monolayers on the biological activity of bioreceptor toward biosensor development. In this project, we choose the organosilanes that can bind covalently to the silicon. Two silanes (7-octenyl trichlorosilane(OTS) and 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES)) were studied., Their impact on the stability and the functionality of bio- receptor , model mouse immunoglobulin G (IgG), were evaluated. Spectroscopic characterization by XPS and infra- red Fourier transformed (FTIR) was first carried out to assess that the silanized surface exhibit carboxylic groups. The homogeneity of the surfaces was measured by AFM. Then, IgG were immobilized on these supports, covalently and a topographic AFM study was conducted to measure the distribution of these antibodies. The orientation of the grafted antibody was investigated by immune-enzymatic assays. We have also evaluated the binding capacity of the IgG immobilized on both surfaces. Then, the impact of aging on APTES surface was evaluated by spectroscopics and biological methods.