Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Au cours de la gestation précoce, la régulation de la physiologie endométriale est cruciale au bon déroulement de l’implantation. Chez les mammifères, une famille de facteurs de transcription est fortement impliquée dans la régulation de la physiologie endométriale, les facteurs STAT. Chez la vache, des analyses haut-débit ont révélé que l’expression endométriale de STAT1 est régulée au cours de la période préimplantatoire. Le but de cette thèse est donc d’apporter de nouvelles données sur l’expression et la régulation endométriales de STAT1 mais également sur ses fonctions biologiques au cours de la gestation précoce chez la vache.Grâce à différents modèles physiologiques et expérimentaux, l’impact de la progestérone, de l’IFNT (signal majeur de reconnaissance maternelle de la gestation chez les ruminants) et de la gestation sur l’expression et la régulation de STAT1 (y compris sa phosphorylation) a été analysé dans l’endomètre bovin et sur des cultures primaires de cellules endométriales. Ainsi, l’expression de STAT1 (transcrit et protéine) ainsi que sa phosphorylation sont augmentés en présence du conceptus et de l’IFNT, indépendamment du taux circulant de progestérone à l’implantation chez la vache. Pour avoir une meilleure connaissance des rôles de STAT1, l’identification de ses gènes cibles a été entreprise : d’abord avec une approche gènes candidats (avec la famille des gènes SOCS), puis par une approche exploratoire.Les facteurs SOCS sont connus pour être des régulateurs négatifs de la voie de signalisation des cytokines. L’utilisation des différents modèles physiologiques et expérimentaux évoqués plus haut a permis l’analyse de l’expression et de la régulation des huit membres de la famille des gènes SOCS au cours de la gestation précoce chez la vache. L’application d’un protocole d’immunoprécipitation de la chromatine sur des cultures primaires de cellules stromales bovines montre le recrutement rapide de STAT1 par l’IFNT sur les promoteurs des gènes SOCS IFNT-dépendants. D’autre part, l’identification systématique des gènes cibles de STAT1 a été entreprise via l’élaboration d’un protocole d’immunoprécipitation de la chromatine suivit de séquençage haut-débit, appliqué à des échantillons d’endomètre bovin. L’ensemble de ces travaux suggèrent l’implication de STAT1 dans la signalisation endométriale de l’IFNT, dans la régulation du système immunitaire maternel et également dans le contôle des phénomènes d’apposition et d’adhérence, fonctions cruciales à l’implantation chez la vache. / During the early stage of the pregnancy, the regulation of the endometrial physiology is crucial to the right establishment of the implantation. In mammals, a transcription factor family is highly involved in the regulation of endometrial physiology, the STAT family. In cattle, high-throughput analyses light up the regulation of endometrial STAT1 expression during the pre-implantation period. Thus, the aim of this work is to bring new insights about endometrial STAT1 expression and regulation but also on its biological functions during the early pregnancy in cattle. Using physiological and experimental models, the impact of progesterone, IFNT (major signal of the maternal recognition of pregnancy in ruminants) and pregnancy on the expression and the regulation of STAT1 transcript and protein (including its phosphorylation status) have been analyzed in the bovine endometrium and endometrial cells. Thus, STAT1 (transcript, protein and phosphorylation) is up-regulated by the presence of the conceptus and by IFNT but independent of progesterone level at implantation in cattle. To better understand endometrial STAT1 functions, the identification of STAT1 target genes has been initiated: first, on a candidate genes family, SOCS genes, and secondly, with an explorative approach.The proteins SOCS are known to be negative regulator of cytokine signalling pathway. Using physiological and experimental models previously quoted, the eight members of SOCS genes expression and regulation were analyzed during the early pregnancy in cattle. Chromatin immunoprecipitation protocol applied on stromal cells show the recruitment of STAT1 on SOCS promoters by a rapid treatment of IFNT. Moreover, the exhaustive identification of STAT1 target gene has been initiated, using a chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing on bovine endometrium samples. Collectively, this data suggests the involvement of STAT1 in IFNT signalling pathway but also in the regulation of maternal immune system and the apposition/adhesion process, all that being crucial for the implantation in cattle.

Le cancer de l’ovaire est le plus mortel des cancers gynécologiques. CA125 est le marqueur de progression utilisé pour effectuer le suivi des patientes atteintes de ce dernier. La protéine CA125 est surexprimée au niveau des tissus ovariens tumoraux, mais elle est non détectable avec les moyens d'aujourd'hui au niveau des tissus ovariens normaux. CA125 est une protéine dont les fonctions demeurent inconnues sinon hypothétiques. Dans notre laboratoire, la recherche est axée sur la détermination des fonctions de l’antigène tumoral CA125. Pour cela un projet de maîtrise précédent au miens a permis la mise au point d’un outil nommé anticorps monovalent modifié (ScFv) dans une lignée de cellules tumorales de l’ovaire. Cet outil permet la liaison de la protéine cible, dans notre cas CA125, et empêche sa localisation physiologique à la membrane, éliminant ainsi sa fonction dans la cellule ciblée. Grâce à cet outil, quelques rôles potentiels ont pu être proposés. CA125 aurait des implications dans la prolifération, l’adhésion cellule-cellule, la résistance à l’apoptose et la migration des cellules tumorales de l’ovaire. Pour étudier cette protéine d’un point de vue moléculaire, mon projet principal consistait à effectuer un criblage double-hybride nucléaire chez la levure pour découvrir des interactions protéiques à une échelle cellulaire. En parallèle, l’utilisation de la méthode d’immunoprécipitation avec des cellules tumorales de l’ovaire en tant que projet secondaire avait pour but de vérifier des voies de signalisation spécifiques. Grâce aux résultats précédents obtenus par des expériences antérieures dans le laboratoire ainsi qu'à ceux obtenus pour d’autres mucines, certaines voies de signalisation démontraient un potentiel intéressant pour l’implication de la protéine CA125. Par des expériences d'immunoprécipitation, nous avons découvert que des complexes protéiques contenant la protéine E-cadhérine et la protéine β-caténine contiennent aussi CA125. Ces protéines sont impliquées dans la prolifération et l’adhésion cellulaire. Certaines fonctions hypothétiques de CA125 sont reliées à ces processus cellulaires, c’est-à-dire l’adhésion cellule-cellule et la prolifération cellulaire. Ces interactions protéiques permettront de mieux comprendre l’implication de CA125 dans ces processus cellulaires. Mon projet principal était la mise au point d’un double-hybride nucléaire chez la levure. Pour y parvenir, nous avons dû modifier les protocoles proposés normalement pour ce type de double-hybride. Nous avions choisi d’effectuer notre criblage avec le domaine cytoplasmique de CA125. Par contre, étant donné que ce domaine est très court seulement 31 a.a., le domaine transmembranaire de CA125 a été ajouté au premier domaine mentionné pour favoriser une conformation protéique adéquate. Le domaine cytoplasmique de CA125 a été choisi pour tenter de mieux comprendre d’un point de vue moléculaire les voies de signalisation dans lesquelles cet antigène tumoral est impliqué. Lors du premier essai pilote de double-hybride effectué, nous avons repêché une protéine qui interagit probablement de manière non spécifique avec CA125 selon des statistiques recueillies lors de criblages pour d’autres protéines transmembranaires. Pour remédier à ce problème majeur, nous avons recherché la source de ce problème. Nous avons alors réalisé que les levures utilisées n’étaient pas les Saccharomyces cerevisiae PJ69-4A que nous avions choisies pour effectuer notre double-hybride. Par la suite, les levures ont été maintenues sur des milieux sélectifs pour les PJ69-4A, c’est-à-dire en absence de lysine (Lys -). Pour parvenir à obtenir des colonies positives lors de la transformation de l’ADN de la librairie avec notre construction, il nous a fallu amplifier les transformants en milieu liquide toute la nuit en sélectionnant pour les vecteurs et la levure. Une fois les transformants amplifiés, nous avons obtenu des candidats potentiels qui ont franchi les différentes étapes de sélection du double-hybride. D’autres techniques ont dû être adaptées à nos besoins pour parvenir à mettre au point notre double-hybride nucléaire chez la levure pour notre protéine transmembranaire. Grâce à ces efforts, certains candidats ont été séquencés et la première protéine découverte par ce criblage est RNF5 (ring finger protein 5). Cette dernière est impliquée dans la régulation de la motilité cellulaire. CA125 semble être aussi impliqué dans ce processus. Il est alors possible de relier CA125 à RNF5. Ce premier résultat nous suggère que nous avons réussi à mettre au point un double-hybride nucléaire chez la levure pour l’antigène tumoral CA125.

Les facteurs de transcription FLI-1 et SPI-1/PU.1 appartiennent à la famille ETS et reconnaissent le même motif sur l'ADN GGAA. Leur activation est observée de manière récurrente dans les érythroleucémies murines induites par le virus de Friend. Ces observations suggèrent un rôle crucial de ces deux facteurs dans la transformation de la lignée érythrocytaire potentiellement par la dérégulation de gènes cibles communs. Mon travail de thèse a consisté à tester la contribution de ces deux facteurs au phénotype des cellules érythroleucémiques et à rechercher les gènes cibles directs communs.Nous avons pu montrer que FLI-1 et SPI-1/PU.1 ont des contributions additives au phénotype des cellules érythroleucémiques surexprimant les deux facteurs. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une grande proportion de gènes cibles directs communs à FLI-1 et à SPI-1/PU.1 impliqués dans différentes étapes de la biogenèse des ribosomes. La déplétion de ces facteurs induit une réduction de la biogenèse des ribosomes qui n'induit pas de stress ribosomique stabilisant p53. Néanmoins, nous avons mis en évidence une contribution spécifique de RPL11, un médiateur essentiel du stress ribosomique, à la différenciation des cellules érythroleucémiques induites par l'absence de ces facteurs.Nous avons mené en parallèle l'inventaire par ChIP-Seq des sites de recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur le génome entier de 3 lignées érythroleucémiques indépendantes. Cette stratégie nous a permis de montrer que les régions de recrutement communes sont la conséquence de la proximité de consensus spécifiques et distincts et du recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur leur propre consensus.

Chez les organismes pluricellulaires, la prolifération, la différenciation ou encore la<br />mort des cellules reposent en partie sur l'activation et la répression de gènes spécifiques. Les<br />profils d'expressions géniques ainsi mis en place sont maintenus d'une génération cellulaire à<br />l'autre par des mécanismes épigénétiques stables qui altèrent la structure de la chromatine au<br />niveau des gènes cibles. Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG)<br />établissent une mémoire cellulaire au cours des mitoses en maintenant l'état transcriptionnel<br />de nombreux gènes par une réorganisation de la structure chromatinienne. Les protéines PcG<br />maintiennent la répression des gènes cibles en créant des domaines chromatiniens compacts<br />où l'ADN est peu accessible. Les protéines TrxG assurent le maintien de l'activation des gènes<br />en bloquant la propagation des complexes PcG et en déplaçant les nucléosomes. Chez la<br />drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes multimèriques qui se lient à la<br />chromatine au niveau de modules communs appelés modules de mémoire cellulaire (CMM).<br />Les PcG et TrxG régulent l'expression de nombreux gènes dont les plus étudiés sont les gènes<br />homéotiques. Aujourd'hui, si les différents acteurs de la mémoire cellulaire commencent à<br />être bien connus, plusieurs questions restent posées. Quels sont les moyens de recruter<br />spécifiquement les PcG et TrxG sur leurs cibles ? Quels sont les mécanismes moléculaires qui<br />permettent le maintien de cette mémoire ? Quels sont les gènes cibles ? Est-ce que les<br />mécanismes d'action que nous étudions au niveau des gènes homéotiques sont communs à<br />l'ensemble des gènes régulés par les PcG et TrxG ?<br />Notre équipe travaille sur une protéine à boîte HMG de drosophile : DSP1 (Dorsal<br />Switch Protein 1). L'étude d'un mutant nul dsp11 a montré que la protéine intervient dans la<br />régulation des gènes homéotiques. Par ailleurs, des études d'interactions génétiques et des<br />expériences de digestion à la DNase I montrent que DSP1 est un facteur de remodelage de la<br />chromatine qui agit suivant le locus considéré en synergie avec les protéines des groupes PcG<br />ou TrxG. DSP1 fait donc partie des protéines qui participent à la mémoire cellulaire.<br />Le travail de thèse que nous présentons ici a pour objectif la recherche des gènes cibles<br />de DSP1 et du rôle de cette protéine dans la régulation de l'expression de ces gènes. Nous<br />avons identifié des cibles préférentielles de DSP1 sur l'ensemble du génome par la technique<br />d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle de DSP1<br />sur l'une de ces cibles, le CMM Fab-7 dont l'activité régule le gène homéotique<br />Ultrabithorax. Au cours de cette étude nous montrons par des expériences de transgenèse que<br />DSP1 est indispensable au fonctionnement du CMM. Le recrutement des protéines PcG et<br />TrxG sur les CMM reste mal connu. La fixation de DSP1 sur le CMM Fab-7 est essentielle au<br />recrutement des PcG. Ainsi nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur<br />précoce de ces protéines suivant le locus considéré au cours de l'embryogenèse. Au contraire,<br />nous montrons que DSP1 intervient tardivement dans l'activation du gène homéotique Sex<br />combs reduced. Dans ce cas, la protéine n'est essentielle qu'au cours de la vie larvaire. Enfin,<br />nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène de segmentation knirps et est impliquée<br />dans l'établissement de son profil d'expression plutôt que dans son maintien.<br />161<br />Les protéines des groupes Polycomb (PcG) et Trithorax (TrxG) établissent une<br />mémoire cellulaire en maintenant l'état transcriptionnel de nombreux gènes par un<br />remodelage de la chromatine. Chez la drosophile, ces protéines agissent au sein de complexes<br />multimériques qui se lient à des unités fonctionnelles appelées Modules de Mémoire<br />Cellulaire (CMM). Quels sont les gènes cibles des protéines PcG/TrxG ? Quels sont les<br />moyens de recruter spécifiquement ces protéines ? Sont deux questions auxquelles nous avons<br />voulu répondre. Notre équipe travaille sur une protéine à boîtes HMG de drosophile : DSP1.<br />L'objectif du travail que nous présentons ici est de rechercher des gènes cibles de DSP1 et son<br />rôle dans la régulation de l'expression de ces gènes. Plusieurs cibles ont été identifiées par la<br />technique d'immunoprécipitation de la chromatine pontée (ChIP). Nous avons étudié le rôle<br />de DSP1 sur le CMM Fab-7 qui régule le gène Ultrabithorax. Nous montrons par des<br />expériences de transgenèse que la fixation de DSP1 est indispensable à l'activité du CMM.<br />Par ailleurs, nous montrons pour la première fois que DSP1 est un recruteur précoce des<br />protéines PcG. Nous montrons également que DSP1 intervient en tant que protéine du groupe<br />TrxG dans l'activation du gène Sex combs reduced. Dans ce cas, DSP1 est essentielle au cours<br />de la vie larvaire. Enfin, nous montrons que DSP1 régule l'expression du gène knirps et<br />participe à l'établissement de son profil d'expression plutôt qu'à son maintien.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La phosphoinositide phosphatase SHIP2 est une protéine capable de moduler le PI(3,4,5)P3, le PI(4,5)P2 et le PI(3,4)P2 qui sont des phosphoinositides importants lors des remaniements membranaires de la cellule. La régulation de la composition en phosphoinositides des membranes permettant l’assemblage de complexes protéiques est primordiale pour la génération de protrusions essentielles pour la migration et l’invasion cellulaire. D’autre part, SHIP2 possède des propriétés d’échafaudage permettant sa participation à plusieurs complexes multi-protéiques et à son ancrage à des localisations subcellulaires spécifiques. Plusieurs études ont montré que SHIP2 pouvait jouer un rôle dans le développement de certains cancers dont le cancer du sein. Au cours de ce travail, nous avons mis en évidence deux nouveaux partenaires de SHIP2 :IRSp53 et CIN85. Ces deux protéines participent respectivement à la formation d’invadopode et à l’endocytose. IRSp53 et CIN85 lient la même région C-terminale riche en prolines (PRR-II) de SHIP2, mais toutefois pas par les mêmes séquences. Cette région contient plusieurs motifs consensus permettant l’interaction de SHIP2 avec plusieurs autres partenaires connus comme l’intersectine, une protéine impliquée dans l’endocytose et Mena, un partenaire commun de SHIP2 et d’IRSp53 impliqué dans l’invasion cellulaire. Nous avons également montré que la mutation de la F1053 située dans la PRR-II de SHIP2 est, essentielle pour la liaison à l’intersectine, impliquée dans la stabilité de la liaison avec Mena et IRSp53 mais pas impliquée dans la liaison de CIN85. De plus, nous montrons qu’à la différence d’IRSp53 qui n’en possède qu’un, CIN85 possède trois domaines SH3 mais ne doit lier que deux motifs dans la PRR-II de SHIP2 afin d’assurer sa complète interaction.Dans les cellules dérivées du cancer du sein MDA-MB-231, nous avons montré que Mena n’est pas nécessaire pour l’interaction entre SHIP2 et IRSp53. Cependant, nous avons observé que l’absence de Mena dans les MDA-MB-231 diminue l’organisation du cytosquelette d’actine-filamenteuse et modifie la localisation subcellulaire de SHIP2 et IRSp53 en augmentant leur concentration à la membrane. Ces données renforcent l’hypothèse que SHIP2 participent à la formation de complexes multi-protéiques qui pourraient favoriser (1) la capacité d’élongation de l’actine de Mena, (2) la courbure de la membrane induite par IRSp53, (3) la production de PI(3,4)P2 par SHIP2 lui-même et (4) le recrutement d’autres protéines participant aux remaniements de la membrane. L’ubiquitination de SHIP2 que nous avons également étudiée pourrait aussi être un élément de régulation de ces complexes. La poursuite de l’étude de la spécificité d’interaction de SHIP2 pour ses divers partenaires dans un contexte pathologique pourrait donc aider à la compréhension de la dynamique des interactions protéiques essentielles au développement de tumeurs et de leurs métastases. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La période de réceptivité endométriale chez l’humain coïncide avec la différentiation des cellules stromales de l’endomètre en cellules hautement spécifiques, les cellules déciduales, durant le processus dit de décidualisation. Or, on sait qu’une transformation anormale des cellules endométriales peut être à l’origine de pertes récurrentes de grossesses. LRH-1 est un récepteur nucléaire orphelin et un facteur de transcription régulant de nombreux évènements relatif à la reproduction et comme tout récepteur, son activation promouvoit l’activité transcriptionnelle de ses gènes cibles. Nous avons déjà montré que LRH-1 et son activité sont essentiels pour la décidualisation au niveau de l’utérus chez la souris et nous savons qu’il est présent dans l’utérus chez l’humain au moment de la phase de prolifération mais aussi de sécrétion du cycle menstruel, et que son expression augmente dans des conditions de décidualisation in vitro. Notre hypothèse est alors la suivante : LRH-1 est indispensable à la décidualisation du stroma endométrial, agissant par le biais de la régulation transcriptionnelle de gènes requis pour la transformation de cellules stromales en cellules déciduales. Afin d’explorer le mécanisme moléculaire impliqué dans la régulation transcriptionnelle effectuée par l’intermédiaire de ce récepteur, nous avons mis en place un modèle de décidualisation in vitro utilisant une lignée de cellules stromales de l’endomètre, cellules humaines et immortelles (hESC). Notre modèle de surexpression développé en transfectant les dites cellules avec un plasmide exprimant LRH-1, résulte en l’augmentation, d’un facteur 5, de l’abondance du transcriptome de gènes marqueurs de la décidualisation que sont la prolactine (PRL) et l’insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). En outre, la sous-régulation de ce récepteur par l’intermédiaire de petits ARN interférents (shRNA) abolit la réaction déciduale, d’un point de vue morphologique mais aussi en terme d’expression des deux gènes marqueurs cités ci-dessus. Une analyse par Chromatin ImmunoPrécipitation (ou ChIP) a démontré que LRH-1 se lie à des régions génomiques se trouvant en aval de certains gènes importants pour la décidualisation comme PRL, WNT 4, WNT 5, CDKN1A ou encore IL-24, et dans chacun de ces cas cités, cette capacité de liaison augmente dans le cadre de la décidualisation in vitro. Par ailleurs, des études structurelles ont identifié les phospholipides comme des ligands potentiels pour LRH-1. Nous avons donc choisi d’orienter notre travail de façon à explorer les effets sur les ligands liés à LRH-1 de traitements impliquant des agonistes et antagonistes à notre récepteur nucléaire. Les analyses par q-PCR et Western blot ont montré que la modulation de l’activité de LRH-1 par ses ligands influait aussi sur la réaction déciduale. Enfin, des études récentes de Salker et al (Salker, Teklenburg et al. 2010) ont mis en évidence que les cellules stromales humaines décidualisées sont de véritables biocapteurs de la qualité embryonnaire et qu’elles ont la capacité de migrer en direction de l’embryon. La série d’expériences que nous avons réalisée à l’aide de cellules hESC placées en co-culture avec des embryons de souris confirme que la migration cellulaire est bien dirigée vers les embryons. Cette propriété quant à l’orientation de la migration cellulaire est notoirement diminuée dans le cas où l’expression de LRH-1 est déplétée par shRNA dans les hESC. Nos données prouvent donc que LRH-1 régule non seulement la transcription d’un ensemble de gènes impliqués dans le processus de décidualisation mais agit aussi sur la motilité directionnelle de ces cellules hESC décidualisées in vitro. / The period of endometrial receptivity in humans coincides with the differentiation of endometrial stromal cells into highly specialized decidual cells through a process known as decidualization. This transformation of endometrial cells is abnormal in recurrent pregnancy loss patients. Liver homolog receptor 1 (LHR-1, NR5A2) is an orphan nuclear receptor and a transcription factor that regulates many reproductive events. The activation of this receptor leads to transcriptional activation of its target genes. We have previously shown that it is essential for decidualization in the mouse uterus. LRH-1 is expressed in the human uterus in both proliferative and secretory phases of the menstrual cycle and its expression increases during in vitro decidualization. We hypothesize that LRH-1 is indispensable for proper decidualization of the endometrial stroma, acting through the transcriptional regulation of genes required for transformation of stromal cells into decidual cells. To explore the molecular mechanism of transcriptional regulation mediated by this receptor, we established an in vitro model of decidualization, using an immortal human endometrial stromal cell line (hESC). An overexpression model developed by transfecting the cells with a plasmid constitutively expressing Lrh-1, resulted in 5 fold increases in abundance of transcripts for the decidualization marker genes prolactin (PRL) and insulin-like growth factor binding protein-1 (IGFBP-1). Furthermore, the downregulation of the receptor using short hairpin RNA (shRNA) abrogates the decidual reaction, from both a morphological point of view and in terms of expression of the two marker genes. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) analysis showed that LRH-1 binds to genomic regions upstream of genes important for decidualization such as PRL, wingless-type MMTV integration site family, member 4 (WNT4), wingless-type MMTV integration site family, member 5 (WNT5), cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, CDKN1A) and interleukin-24(IL-24). For each of these genes, the binding increased during in vitro decidualization. Structural studies have identified phospholipids as potential LRH-1 ligands. We therefore explored the effect of ligand treatment on LRH-1 with an agonist and an inverse agonist for the nuclear receptor. Analysis by quantitative polymerase chain reaction (qPCR) and Western blot demonstrated that the modulation of LRH-1 activity by its ligands also affects the decidual reaction. Recent studies have shown that decidualized human stromal cells are biosensors of embryo quality and that they have the capacity to migrate towards the embryo. Our time-lapse evaluation of hESC cells co-cultured with mouse embryos indicates directed migration of the cells toward the embryo. This effect is markedly diminished when LRH-1 is depleted by shRNA in hESC. Our data provide evidence that LRH-1 regulates not only the transcription of a set of genes involved in decidualization but also the directional motility of these cells in vitro.

Les facteurs de transcription FLI-1 et SPI-1/PU.1 appartiennent à la famille ETS et reconnaissent le même motif sur l’ADN GGAA. Leur activation est observée de manière récurrente dans les érythroleucémies murines induites par le virus de Friend. Ces observations suggèrent un rôle crucial de ces deux facteurs dans la transformation de la lignée érythrocytaire potentiellement par la dérégulation de gènes cibles communs. Mon travail de thèse a consisté à tester la contribution de ces deux facteurs au phénotype des cellules érythroleucémiques et à rechercher les gènes cibles directs communs.Nous avons pu montrer que FLI-1 et SPI-1/PU.1 ont des contributions additives au phénotype des cellules érythroleucémiques surexprimant les deux facteurs. Par une approche transcriptomique, nous avons identifié une grande proportion de gènes cibles directs communs à FLI-1 et à SPI-1/PU.1 impliqués dans différentes étapes de la biogenèse des ribosomes. La déplétion de ces facteurs induit une réduction de la biogenèse des ribosomes qui n’induit pas de stress ribosomique stabilisant p53. Néanmoins, nous avons mis en évidence une contribution spécifique de RPL11, un médiateur essentiel du stress ribosomique, à la différenciation des cellules érythroleucémiques induites par l’absence de ces facteurs.Nous avons mené en parallèle l’inventaire par ChIP-Seq des sites de recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur le génome entier de 3 lignées érythroleucémiques indépendantes. Cette stratégie nous a permis de montrer que les régions de recrutement communes sont la conséquence de la proximité de consensus spécifiques et distincts et du recrutement de FLI-1 et de SPI-1/PU.1 sur leur propre consensus. / The transcription factors FLI-1 and SPI-1/PU.1 belong to the ETS family and recognize the same DNA motif GGAA. Their activation is recurrently observed in murine erythroleukemia induced by Friend virus. These observations suggest a crucial role of these two factors in erythroid lineage transformation potentielly by deregulating common target genes. My thesis work consisted of testing both factors contribution to the phenotype of erythroleukemia cells and of searching for common direct target genes.We showed that FLI-1 and SPI-1/PU.1 have additive contributions to the phenotype of erythroleukemia cells overexpressing both factors. By a transcriptomic approach, we identified a high proportion of common direct target genes of FLI-1 and SPI-1/PU.1 involved in ribosome biogenesis at different levels. The déplétion of these factors induced a decrease of ribosome number which doesn’t induce a ribosomal stress leading to the p53 stabilization. However, we highlighted a specific contribution of RPL11, an essential ribosomal stress médiator, in erythroleukemia cell differentiation induced by depletion of both factors. In parallel, we mapped at whole génome scale by ChIP-Seq the recruitment site of FLI-1 and SPI-1/PU.1 in 3 independent erythroleukemia cell lines. This strategy allowed us to show that the common recruitment régions are the conséquence of a very close association of clearly distinct and specific consensus binding sites for FLI-1 and SPI-1/PU.1 and that each of those factor sis recruited to its own consensus.

Le fer est à la fois indispensable et toxique pour les cellules. Un contrôle strict de son métabolisme est nécessaire pour pourvoir aux besoins des cellules tout en évitant ses effets délétères. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, ce contrôle est assuré par les activateurs transcriptionnels paralogues Aft1p et Aft2p. En condition de carence en fer, Aft1p active la transcription des gènes du transport à haute affinité du fer extracellulaire en se fixant sur la séquence cis-régulatrice 5'-TGCACCC-3'. Le rôle d'Aft2p est moins bien caractérisé ; il reconnaît in vitro la même séquence consensus qu'Aft1p et active la transcription de plusieurs gènes régulés par Aft1p lorsqu'il est surexprimé ou sous une forme mutée constitutivement active. Nous avons cherché à mieux comprendre le rôle d'Aft2p en condition de carence en fer en identifiant ses gènes cibles et en caractérisant son mode d'action, par une combinaison d'expériences d'analyses globales de transcriptome, de Northern blot et d'immunoprécipitation de la chromatine réalisées avec les souches sauvage et délétées d'AFT1 et/ou d'AFT2. Nous avons montré qu'Aft2p, mais pas Aft1p, active directement la transcription des gènes de l'utilisation et du stockage du fer intracellulaire. Nous avons mis en évidence que la séquence cis-régulatrice des gènes régulés par Aft2p n'est pas 5'-TGCACCC-3', mais une séquence plus courte, 5'-(G/A)CACCC-3'. Aft2p joue également un rôle direct dans la régulation transcriptionnelle de plusieurs gènes du métabolisme du zinc, et il pourrait intervenir dans la régulation des gènes du métabolisme de l'ergostérol et des acides gras. Par ailleurs, nous avons montré l'existence d'une régulation par le fer de la quantité des protéines Aft1p et Aft2p. La variation de quantité d'Aft1p semble résulter de son autorégulation transcriptionnelle, alors que la variation de quantité d'Aft2p implique une régulation post-transcriptionnelle.