Modulation de la réponse lymphocytaire T par IL4I1 - RESUME : L’enzyme Interleukin-four Induced Gene 1 (IL4I1), qui dégrade la phénylalanine, est exprimée par des cellules présentatrices d’antigène (CPA) en réponse à des stimuli pro-inflammatoires. Elle affecte la prolifération et les fonctions lymphocytaires T et pourrait donc participer au rétrocontrôle des réponses immunitaires. Cependant, les mécanismes d’action d’IL4I1 restent encore mal connus. Mon projet de thèse a comporté deux axes. Dans un premier axe, j’ai participé à la caractérisation du rôle d’IL4I1 dans la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs en lymphocytes T régulateurs et T auxiliaires effecteurs. Dans mon deuxième axe, qui représente la majeure partie de mon travail, j’ai analysé l’action d’IL4I1 sur les évènements précoces de l’activation T. J’ai observé qu’IL4I1 inhibe la phosphorylation de ZAP70 dès les premières minutes d’activation. Ce défaut se propage aux trois voies de signalisation principales : la voie calcique, la voie des MAP kinases et la voie NFκB. Elle retentit secondairement sur la capacité à former des synapses avec les CPA, ainsi que sur l’expression de différents marqueurs membranaires d’activation. L’activité enzymatique d'IL4I1 n’est pas responsable du défaut d’activation observé. L’étude des synapses CPA-T a montré une polarisation des vésicules de sécrétion contenant IL4I1 en direction de la cellule T ainsi qu’occasionnellement leur présence au contact du lymphocyte T. Des expériences complémentaires confirment la fixation d’IL4I1 sur les lymphocytes T. Ces données suggèrent un nouveau mécanisme d’action d’IL4I1 dépendant de sa liaison à un récepteur membranaire de la cellule T. - Mots clefs : Interleukin-4 induced gene 1 (IL4I1), enzyme immunosuppressive, signalisation du lymphocyte T / Modulation of the T cell response by IL4I1 - SUMMARY: The enzyme Interleukin-four Induced Gene 1 (IL41I), which degrades phenylalanine, is expressed by antigen presenting cells (APC) in response to pro-inflammatory stimuli. IL4I1 modifies the proliferation and function of T lymphocytes, and may participate in the negative feedback of the immune response. Its mechanism of action remains poorly understood.My thesis project included two tasks. In the first task, I participated in the characterisation of the role of IL4I1 in naive CD4+ T cell differentiation into regulatory and helper T lymphocytes. In the second task, and the main part of my thesis, I have studied the effect of IL4I1 on early T cell activation. I observed that ZAP70 phosphorylation was rapidly decreased after TCR stimulation. This alteration was transmitted to the three main downstream signalling pathways: calcium fluxes, the MAP kinase pathway, and the NFκB pathway. The enzymatic activity of IL4I1 was not responsible for the observed decreased activation. Analysis of the APC-T cell synapse showed the polarised secretion of IL4I1 toward the T cell. Labelling of IL4I1 was sometimes detected directly on T lymphocytes. Complementary experiments indicate that IL4I1 binds to T lymphocytes. These data suggest a new mechanism of action of IL4I1 dependent on its ability to bind a membrane receptor on T lymphocytes. - Key-words: Interleukin-4 induced gene 1 (IL4I1), Immunosuppressive Enzyme, T lymphocyte signalling.

La protéine IL4I1 est une enzyme sécrétée dont l’activité L-amino acide oxydase vis-à-visde la phénylalanine inhibe la prolifération des lymphocytes T in vitro (Boulland et al, Blood 2007).Comme d’autres enzymes immunosuppressives, elle est exprimée dans les tumeurs au niveau descellules myéloïdes et/ou des cellules tumorales (Carbonnelle-Puscian et al, Leukemia 2009). Le but decette thèse a été de caractériser les conditions d’expression d’IL4I1 et de comprendre son rôle dans lecancer.Nous avons montré que les macrophages et les cellules dendritiques représentent la principalesource d’IL4I1 in vitro et dans des lésions inflammatoires chroniques. L’expression d’IL4I1 dans lesphagocytes mononucléés est induite par les interférons ou les ligands de TLR, activant respectivementSTAT1 et NF-kB, tandis que les lymphocytes B expriment des niveaux nettement plus faibles d’IL4I1sous le contrôle de la voie IL-4/STAT6 et de la voie CD40/NFkB. L’expression d’IL4I1 par des cellulesmonocytaires inhibe la production de cytokines Th1 et pourrait donc contribuer à la régulation del’inflammation Th1 in vivo.Dans un modèle murin de cancer, l’expression d’IL4I1 facilite le développement tumoral endiminuant la réponse T cytotoxique spécifique de la tumeur. Ceci est observé à des niveaux d’activitéIL4I1 proches de ceux mesurés dans des tumeurs humaines, suggérant qu’IL4I1 puisse contribuer àl’échappement des tumeurs au système immunitaire chez l’homme. Nous avons développé plusieursmutants d’IL4I1, afin d’évaluer l’impact de l’activité enzymatique versus celui de l’éventuelle liaison del’enzyme à un récepteur, dans l’effet protumoral observé. Un de ces mutants est actuellementdisponible pour une étude chez la souris.Nos résultats installent définitivement IL4I1 dans le panorama des enzymesimmunosuppressives associées au cancer et ouvrent la voie au développement d’inhibiteursspécifiques comme outils thérapeutiques / The IL4I1 protein is a secreted L-amino acid oxidase, which inhibits T cell proliferationthrough phenylalanine degradation in vitro (Boulland et al, Blood 2007). Similar to previously describedimmunosuppressive enzymes, IL4I1 is expressed in cancer by myeloid cells and/or tumor cells(Carbonnelle-Puscian et al, Leukemia 2009). The aim of this work was to characterize the cells andstimuli associated with IL4I1 expression and to decipher its role in cancer.We showed that macrophages and dendritic cells are the main source of IL4I1 in vitro and inchronic inflammatory lesions. IL4I1 expression in mononuclear phagocytes is induced by interferons orTLR ligands, which act through STAT1 and NFkB respectively. Conversely, B cells express dramaticallylower levels of IL4I1 under the control of IL-4/STAT6 and CD40/NFkB. IL4I1 expression by monocyticcells inhibits the production of Th1 cytokines and may thus contribute to Th1 inflammation control invivo.In a murine model of cancer, IL4I1 expression facilitates tumor development by depressing thetumor specific cytotoxic T cell response. This is observed for IL4I1 activity levels in the range of thosemeasured in human tumors, suggesting that IL4I1 may contribute to tumor immune escape in humans.We developed several IL4I1 mutants to discriminate the role of the enzymatic activity versus the bindingto a putative cell surface receptor in the protumor effect observed. One of these mutants is currentlyavailable for in vivo testing.Our results definitively establish IL4I1 in the family of immunosuppressive enzymes associatedwith cancer and pave the way for the development of specific inhibitors as therapeutic tools

Les travaux de l'équipe ont permis de montrer qu'IL4I1 est une L-amino acide oxydase sécrétée par les cellules d'origine myéloïde dégradant la phénylalanine en H2O2, NH3 et phénylpyruvate. Elle est fortement exprimée au sein des tumeurs humaines et facilite l'échappement tumoral dans un modèle de mélanome murin. Cette enzyme inhibe l'expression de la chaîne ζ du TCR ainsi que la prolifération des lymphocytes T effecteurs/mémoires via la production d'H2O2. IL4I1 appartient donc à une famille d'enzymes régulatrices des réponses immunitaires impliquées dans la défaillance de la réponse anti-tumorale.Au cours de ma thèse, j'ai montré qu'IL4I1 induit la différenciation des lymphocytes T CD4+ naïfs conventionnels en cellules CD25fortFoxP3+ chez l'Homme et la souris. Ces cellules exercent une action suppressive in vitro équivalente à celle de cellules régulatrices obtenues sans IL4I1 et leur phénotype est similaire. La promotion de la différenciation Treg par IL4I1 a pu être observée dans différentes conditions in vitro et s'avère particulièrement importante lorsque les cellules sont cultivées sans ajout d'IL2 et de TGFβ. Le mécanisme impliqué reposerait en partie sur la consommation de Phe par l'activité enzymatique qui serait responsable de l'inhibition de la voie mTORC1 observée.En conclusion, nous avons démontré un nouveau rôle d'IL4I1 sur les lymphocytes T. Ainsi, en inhibant la prolifération des lymphocytes T et en induisant la polarisation Treg, IL4I1 pourrait jouer un rôle important dans l'échappement tumoral. IL4I1 étant sécrétée et peu exprimée à l'état physiologique, elle pourrait être la cible de traitements adjuvants dans le cancer. / Our team has shown that IL4I1 is a secreted L-amino acid oxidase which degrades phenylalanine into H2O2, NH3 and phenylpyruvate.. This enzyme is produced by myeloid cells and expressed within human cancers. IL4I1 expression facilitates tumor growth in a mouse model. IL4I1 inhibits TCRζ chain expression and T lymphocyte proliferation via H2O2 production. Therefore IL4I1 belongs to a family of enzymes endowed with immune regulatory functions involved in the anti-tumor response failure.During my PhD, I showed that IL4I1 induces CD25highFoxP3+ cells differentiation from conventional naïve CD4+ T cells, both in humans and mice in vitro systems. These cells exert similar in vitro suppressive activity than those obtained without IL4I1 with a similar phenotype. Treg differentiation promotion by L4I1 is observed in various in vitro conditions and is particularly important when cells are cultured without addition of IL2 and TGFβ. The involved mechanism would partially depend on the phenylalanine consumption by the enzymatic activity which would be responsible for the mTORC1 pathway inhibition observed.In conclusion, we have demonstrated a new mechanism of IL4I1 action on T lymphocytes. Thus, by inhibiting T lymphocytes proliferation and by inducing Treg polarization, IL4I1 could play an important role in tumor escape. Since IL4I1 is secreted and weakly expressed under physiological conditions, it could be the target of adjuvant therapy in cancer.