Die Transplantation nimmt, mehr noch als die verschiedenen Dialyseverfahren, den höchsten Stellenwert in der Therapie eines terminalen Nierenversagens ein. Eine Transplantation erfordert jedoch auch immer eine suffiziente Immunsuppression, ohne die die Funktionalität des Transplantats nicht gewährleistet werden kann. Kortikosteroide werden dabei immer noch sehr häufig nach Nierentransplantation eingesetzt. Jedoch bringt diese Medikation auch Risiken mit sich. In der vorliegenden retrospektiven Analyse wurden die Daten von insgesamt 809 Patienten ausgewertet. Die Patienten wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, wobei zwischen steroidfrei und nicht-steroidfrei in Jahr zwei nach Transplantation unterschieden wurde. Untersucht wurde, ob es Unterschiede im Patienten- und Transplantatüberleben, bei akuten Abstoßungen oder bei steroidtypischen Nebenwirkungen gibt. Wir konnten ein tendenziell besseres Patientenüberleben in der steroidfreien Gruppe feststellen, vor allem zu sehen an der Zehn-Jahres-Überlebensrate (86,0% vs. 79,8%). Bezüglich des Transplantatüberlebens zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied zugunsten der steroidfreien Patienten (nach fünf Jahren 92,2% vs. 79,7%). Ein Transplantatverlust war in der steroidfreien Kohorte seltener zu beobachten (23,1% vs. 33,8%). Bei den in Jahr zwei steroidfreien Patienten ereigneten sich weniger akute Abstoßungsereignisse, sowohl bioptisch gesicherte als auch nur klinisch verdächtige Episoden. Steroidtypische Nebenwirkungen, zum Beispiel ein Posttransplantationsdiabetes sowie kardiovaskuläre Ereignisse wurden tendenziell häufiger in der Kohorte mit fortgesetzter Steroideinnahme diagnostiziert. Im Auftreten von Malignomen gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Zu beachten ist die Möglichkeit eines Selektionsbias bei der retrospektiven Auswertung. Somit ergeben sich in unserer Analyse für eine verkürzte Einnahme von Steroiden nach Transplantation greifbare Vorteile für das Patienten- und Transplantatüberleben. Die Steroidtherapie sollte jedoch mindestens bis sechs Monate nach Transplantation beibehalten werden. Nach diesem Zeitraum erscheint das Absetzen der Steroide sicherer zu sein, da akute Abstoßungsepisoden seltener auftreten. Sowohl Patienten- und Transplantatüberleben werden durch das Absetzen der Steroidtherapie günstig beeinflusst. Ein früheres Absetzen, wie es in anderen Studien durchgeführt wurde, führte häufiger zu höheren Raten an akuten Rejektionen. Kortikosteroide waren und bleiben somit ein unverzichtbarer Teil der initialen immunsuppressiven Therapie nach Nierentransplantation. / We analyzed the long-term results of a steroid-free immunosuppressive regimen one year after renal transplantation. In this retrospective analysis 809 patients were included who underwent renal transplantation between 1984 an 2012. The patients were divided into two groups: Patients who continued taking steroids one year after transplantation and patients who were withdrawn from steroids after one year after transplantation. Both groups were matched for baseline parameters. In the steroid withdrawal-group we found lower overall-mortality rates compared to steroid-continuation-patients. Also there were less graft losses in the CSW group.

Universiẗat, Diss., 2005--Würzburg.

Die MV-induzierte Immunsuppression ist unter anderem durch eine Leukopenie gekennzeichnet und so wurde in der vorliegenden Studie die Frage nach den Auswirkungen einer Interaktion des MV mit Knochenmarkszellen adressiert. Humane HSC, multipotente und oligopotente hämatopoetische Vorläuferzellen (HPC) können, im Gegensatz zu murinen, nicht anhand des SLAM-codes unterschieden werden. Während CD244 auf allen HS/PC exprimiert wird, markieren CD150 und CD48 eher humane HPC als HSC. Trotz vorhandener CD150+-HPC beschränkt sich die Infektion mit wildtypischen MV nicht auf diese Subpopulation, sondern erfolgt, wie bei CD150- Stromazellen, unabhängig von diesem Rezeptor. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass die MV-Exposition von HS/PC in vitro weder deren Proliferation noch die Fähigkeit zur Koloniebildung stört. Dass sich eine MV-Infektion in Kokulturen von HS/PC mit Stromazellen vom jeweils einen auf den anderen Zelltypen überträgt, könnte als möglicher Mechanismus zur Ausbreitung und Etablierung einer Infektion im Knochenmark angesehen werden. Obwohl in vitro keine Inhibition der Expansion von HS/PC beobachtet wurde, stört eine vorangegangene MV-Exposition die Kurzzeitrekonstitution bestrahlter NOD/SCID-Mäuse massiv. Diese Inhibition der Hämatopoese ist jedoch transient und hat keine Auswirkungen auf die Langzeitrekonstitution. Da weder die Migration der transplantierten HS/PC zum Knochenmark gestört ist noch die Knochenmarkszellen der Maus permissiv für eine MV-Infektion sind, ist die beobachtete Inhibition auf einen direkten Einfluss der MV-Exposition auf die HS/PC zurückzuführen. / MV-induced immunosuppression is marked by leukopenia so that we addressed the question whether the interaction of MV with bone marrow cells would have any consequences. In contrast to their murine counterparts, human HSC, multipotent and oligopotent hematopoietic progenitor cells (HPC)cannot be distinguished based on the SLAM-code. While CD244 is expressed by all HS/PC, CD150 and CD48 rather mark human HPC than HSC. Though CD150+-HPC exist, the infection by wild type MV is not restricted to this subpopulation but occurs, as for the CD150- stroma cells as well, CD150-independently. Furthermore it was shown that MV-exposure of HS/PC neither affects their proliferation nor their ability to form colonies in vitro. MV is mutually transmitted in co-cultures of HS/PC and stroma cells from one cell type to the other, and this might be a possible way for the virus to spread and to establish an infection within the bone marrow. Although MV-exposure does not affect HS/PC-expansion in vitro, it massively inhibits short term reconstitution of irradiated NOD/SCID-mice. However, this inhibition of hematopoiesis remains transient and has no consequences for long term reconstitution. Since transplanted HS/PC home normally and murine bone marrow cells do not support MV-replication, the effects observed on hematopoiesis can only be explained by a direct influence of MV-exposure to HS/PC.

Die Infektion mit MV Wildtypvirus führt zu einer starken Immunsuppression und Sekundärinfektionen, die bei der Immunisierung mit einem attenuierten Vakzinestamm nicht auftreten. In vitro Studien zeigen, dass sowohl MV Wildtyp- als auch Impfstamminfizierte Zellen die Mitogen-induzierte Proliferation von humanen Blutlymphozyten inhibieren. Zur Bestätigung dieser Befunde im Baumwollrattenmodell wurde gezeigt, dass in vitro MV-infizierte Zellen die Proliferation der naiven Milzzellen hemmen und keine Unterschiede zwischen Wildtypen und Impfstämmen bestehen. Im Gegensatz dazu wurden nach intranasaler Infektion von Baumwollratten Unterschiede hinsichtlich der Proliferationsinhibition, Virusreplikation und Ausbreitung zwischen Wildtypvirus WTF und Impfstamm Edm gefunden. Nach intranasaler Infektion mit 105 TCID50 WTF war am Tag 4 die Proliferation bis zu 40% inhibiert. Bis zu 20 Tagen nach Infektion mit WTF wurde eine Proliferationsinhibition gemessen und das Virus in den drainierenden Lymphknoten bis Tag 4 nachgewiesen. Die intranasale Infektion mit Dosen von 103 TCID50 WTF bzw. mit 2-4x106 TCID50 Edm konnten im gleichem Maße die T-Zell- Proliferation hemmen. Somit war eine 1000fach niedrigere Dosis an WTF ausreichend, die gleiche hemmende Wirkung zu erzielen. Der gleiche Effekt wurde bei weiteren Wildtypstämmen (Bilthoven, ICB) und Impfstämmen gefunden. Eine Ursache für den unterschiedlich immunsuppressiven Effekt zwischen Wildtypen und Impfstämmen könnte die unterschiedliche Rezeptornutzung sein. Wildtypviren benutzen CD150 als Rezeptor und Impfstämme sowohl CD150 als auch CD46. Die Impfstämme wurden ursprünglich von Edm Wildtyp durch Passagierung auf Fibroblasten-Zellinien attenuiert und adaptierten an die CD46-Rezeptornutzung. Durch die dabei erfolgte Adaptation an CD46 wurde der Virus attenuiert. Dieses Phänomen konnte auch nach Passagierung eines Wildtypvirus auf verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Der auf lymphoiden Zellen passagierte Wildtyp WTFb und der auf Fibroblasten-Zellen WTFv passagierte haben unterschiedliches immunsuppressives Potential. Interessanterweise zeigte Edm-Wildtyp nach 9 Passagen auf Fibroblasten- Zellinien einen attenuierten Phänotyp im Baumwollrattenmodell. Allerdings revertierte dieser Virus bereits nach 3 Passagen in der Baumwollratte zu einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus. Die Untersuchung der rekombinanten Viren Edm (WTF H), Edm (WTF F) und Edm (WTF H+F) zeigte, dass Impfstämme, welche das Oberflächenprotein H von WTF anstelle des H-Proteins von Edm tragen, proliferationshemmend sind und sich im Organismus ausbreiten. Das F-Protein von Edm oder WTF hatte keinen Einfluß auf Immunsuppression und Virusausbreitung, Die Rückmutation in dem WTF H-Protein an der Aminosäure-Position 481 von Aspargin zu Tyrosin (N481Y) veränderte die Rezeptornutzung von CD46 auf CD150 und den Phänotyp von einem immunsuppressiven, sich ausbreitenden Virus zu einem nichtimmunsuppressiven, nicht-ausbreitenden Virus. Da die Aminosäureposition 481 einen starken Einfluß auf die Benutzung von CD46 oder CD150 ausübt, scheint somit das HProtein von WTF die immunsuppressive Wirkung und Virusausbreitung maßgeblich zu beeinflussen. Wie beim Menschen konnten in der Baumwollratte MV-infizierte Makrophagen nachgewiesen werden. Durch die Infektion mit einem GFP-MV wurde die Virusreplikation nachgewiesen, das Virus wurde aus Makrophagen rückisoliert und durch Kokultivierung mit Indikatorzellen die Ausprägung des zytopathischen Effektes fluoreszenzmikroskopisch beobachtet. Weitere Untersuchungen zeigten Unterschiede zwischen WTF und Edm-infizierten Makrophagen hinsichtlich der Proliferationsinhibition von Milzzellen. Der direkte Kontakt von Wildtyp WTFinfizierten Makrophagen hemmte die T-Zell-Proliferation. Dagegen wurde durch Edminfizierte Makrophagen keine T-Zell-Proliferationinhibition ausgelöst. Erklären läßt sich das möglicherweise mit dem unterschiedlichen Sekretionsprofil verschiedener Interleukine von WTF und Edm-infizierten Makrophagen, da bei WTF-infizierten Makrophagen eine Unterdrückung der Produktion von IL-12 gefunden wurde. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die im Menschen beobachteten Unterschiede hinsichtlich Virusausbreitung und Immunsuppression zwischen Wildtypenund Impfstämmen mit den Befunden in der Baumwollratte übereinstimmen. Außerdem konnte festgestellt werden, dass die Interaktion von MV H-Protein und den Rezeptoren mit der Immunsuppression und Virusausbreitung korreliert. Die Unterdrückung der Sekretion von IL-12 in Makrophagen aus der Baumwollratte könnte die Hypothese unterstützen, dass die Immunsuppression während der MV-Infektion durch eine fehlgeleitete Th2-Antwort begünstig wird. / Infection with MV wild type virus leads to a strong immune suppression and secondary infection, neither of which occurs as a result of immunization with an attenuated vaccine strain. In vitro studies show that wild type MV as well as vaccine strain infected cells inhibit the mitogen-induced proliferation of human blood lymphocytes. As confirmation of these results, it has been shown that in vitro MV-infected cotton rat cells cause a decrease in proliferation of naive spleen cells with no difference between the wild type and vaccine strain. Differences in proliferation inhibition, virus replication, and viral spread were, however, found after intranasal infection of cotton rats using either wild type virus (WTF) or vaccine strain (Edm). Intranasal infection with 105 TCID50 WTF leads to proliferation inhibition of up to 40% on day 4 p.i.. Proliferation inhibition was observed up to 20 days after infection with WTF and virus has been isolated up to day 4 in the draining lymph nodes. Furthermore, a dose of 103 TCID50 WTF was sufficient to inhibit the proliferation of T-cells, and to allow for the isolation of virus from the draining lymph nodes. In comparison infection with 105 TCID50 Edm did not cause any proliferation inhibition and no virus could be detected in draining lymph nodes. It was found that intranasal infection with 103 TCID50 WTF and 2-4 x 106 TCID50 Edm restricted T-cell growth to a similar extent. Thus a 1000-fold lower dose of WTF was sufficient to attain an equivalent restriction of T-cell proliferation. This effect was also found for other wild-type (Bilthoven, ICB) and vaccine strains. The differential immunosuppressive effect between wild type and vaccine strains may be caused by differences in receptors used by these viruses. Wildtype viruses use CD150 as a receptor while vaccine strains can use either CD150 or CD46. The vaccine strains were originally attenuated by passaging on fibroblast-cell lines and adapted to use CD46. The virus was attenuated through adaptation to CD46. This phenomenon was shown after passaging a wild-type virus on different cell lines. WTF-b, passaged on lymphoid cell lines, and WTF-v, passaged on fibroblast cells vary in their immunosuppressive potential. Interestingly, Edm-wild type showed an attenuated phenotype in the cotton rat model after 9 passages on fibroblast cell lines. However, this virus reverted after 3 passages to a immunosuppressive, disseminating virus. Investigation of the recombinant viruses Edm (WTF H), Edm (WTF F) and Edm (WTFH+F) showed that the vaccine strains which carry the surface protein H from WTF instead of that of Edm restrict proliferation and disseminate in the infected organism. The F-protein, whether from Edm or WTF, did not have an influence on the immune suppression and virus dissemination. The reverse mutation of the WTF H-protein at the amino acid position 481 from asparagine to tyrosine (N481Y) changes receptor use from CD46 to CD150 and the phenotype from immunosuppressive, disseminating to non-immunosuppressive, non-disseminating virus. Because the amino acid position influences the use of CD46 or CD150 strongly, the H protein from WTF appears to have considerable influence on the immunosuppressive effect and virus dissemination. As in MV infected humans, infected macrophages were detected in the cotton rat. Virus replication was demonstrated through infection with a MV expressing green fluorescent protein, the virus was reisolated from macrophages, and the development of the cytopathic effect in co-cultivated indicator cells was observed using light microscopy. Further investigations showed differences between WTF and Edm infected macrophages in respect to the proliferation inhibition of spleen cells. The direct contact of wild type WTF-infected macrophages restricted T-cell proliferation. On the other hand, no T-cell proliferation inhibition was caused by Edm infected macrophages. This can possibly be explained by the differences in secretion profiles by macrophages infected with WTF or Edm of various interleukins, as a supression of IL-12 production was found in WTF infected macrophages. In the presented work, it was shown that the differences between wild-type and vaccine strain viruses in the context of virus dissemination and immune suppression as noted in humans were in agreement with findings in the cotton rat. In addition, it was determined that the interaction of the H-protein with its receptors correlated with immunosuppression and virus dissemination. The suppression of IL-12 secretion by macrophages isolated from cotton rats supports the hypothesis that the immune suppression during MV infection is favoured by a misdirected Th2 response.

Im Rahmen dieser Dissertation wurde die Bedeutung der Glykoproteine Fusionsprotein (F) und Hämagglutinin (H) des Masernvirus (MV) für die MVinduzierte Immunsuppression analysiert. Die erhöhte Empfänglichkeit von MVinfizierten Kindern für Sekundärinfektionen wird auf die ausgeprägte Immunsuppression zurückgeführt, die während und noch Monate nach einer Infektion beobachtet wird. Isolierte periphere Blutlymphozyten (PBL) von MVinfizierten Personen zeigen in Gegenwart von Mitogenen eine stark reduzierte Proliferation ex vivo, die als Parameter für die Immunsuppression verwendet wird. Die Inhibition der Proliferation wird auf die viralen Glykoproteine F und H zurückgeführt und nur Wildtypviren sind in der Lage, eine klinisch relevante Immunsuppression auszulösen. Die Mechanismen, die dieser Immunsuppression zugrunde liegen, sind jedoch nicht vollständig geklärt. Um den immunsuppressiven Effekt von F und H in einem genetisch und immunologisch gut charakterisiertem Tiermodell näher analysieren zu können, wurde in der vorliegenden Arbeit ein neues transgenes Mausmodell etabliert. Es wurde ein konditionell transgenes Mausmodell gewählt, in dem die für die Immunsuppression verantwortlichen MV-Glykoproteine eines Wildtypstammes gewebespezifisch und Tetrazyklin-regulierbar exprimiert wurden (Tet-System). Mit Hilfe der Mikroinjektion wurde ein auffällig kleine Anzahl an transgenen Tieren hergestellt. Aus 780 Mikroinjektionen gingen nur vier transgene Mäuse hervor, die F und H unter Kontrolle eines Transaktivator-abhängigen bidirektionellen Promotors in ihrem Genom enthielten. Dies war ein erster Hinweis für eine starke Selektion gegen die Expression von F und H in diesem Tiermodell. Die verschiedenen Mauslinien konnten in dieser Arbeit vollständig charakterisiert werden. Um auch einzelne Kopien des Transgens nachweisen zu können, wurde eine hochsensitive Genotypisierungs-PCR und ein sensitiver Southern-Blot etabliert. Es wurde gezeigt, daß eine der vier Mauslinien eine einzelne Kopie und die restlichen drei Linien ungefähr 10 Kopien in tandemartiger Anordnung in ihrem Genom enthielten. Zusätzlich konnte mit Southern-Blot-Analysen nachgewiesen werden, daß die Integration der Transgene in eine einzige Stelle des Genoms stattgefunden hatte. Es wird angenommen, daß die geringe Anzahl an transgenen Mäusen auf eine schädliche Restexpression von F und H während der Embryogenese zurückzuführen ist, und nur Tiere mit einer starken Expressionskontrolle des Transgens geboren wurden. Dies wird unterstützt durch die Tatsache, daß keine der vier transgenen Mauslinien eine Restexpression von F und H aufwies. Bei der Kreuzung der Mäuse zu homozygoten Linien stellte sich heraus, daß eine Linie in homozygoter Form nicht züchtbar war. Es handelte sich wahrscheinlich um eine Insertionsmutante. Die restlichen drei Linien wurden mit T-Zell-spezifischen Induziermäusen gekreuzt, um doppelt-transgene Mäuse mit Tetrazyklinregulierbarer Expression von F und H in T-Zellen herzustellen. Expressionsanalysen zeigten, daß in zwei doppelt-transgenen Linien das Transgen stumm blieb. In der letzten verbleibenden Linie konnte die Trankription von F- und H-mRNA in Milz (in vitro) und Thymus (in vitro und in vivo) nachgewiesen werden. Die Expression war allerdings so schwach, daß nur ein Tier eine leichte Produktion von H-Protein im Thymus aufwies. All diese Beobachtungen deuten auf eine starke Selektion gegen eine Expression von F und H. In dem neu etablierten Mausmodell wurden die Auswirkungen der Expression von F und H in vivo überprüft. In einzelnen doppelt-transgenen Mäusen der induzierbaren Linie wurde eine schwache MV-spezifische B- und T-Zellantwort nachgewiesen. Allerdings konnte keine Immunsuppression induziert werden, und auch kein Einfluß der Glykoproteine auf die Thymozytenanzahl festgestellt werden. Weiterhin wurden durch eine Langzeit-Expression von F und H über 23 Wochen keine geringen immunsuppressiven Effekte kumulativ über die Zeit sichtbar. Diese geringen Auswirkungen werden auf die schwache Expression der MVGlykoproteine F und H zurückgeführt. Mit Hilfe des in dieser Arbeit etablierten Mausmodells wurde gezeigt, daß die Expression der MV-Glykoproteine F und H einen starken toxischen Effekt auf Mäuse ausübt. Dieser toxische Effekt könnte bei der MV-induzierten Immunsuppression eine Rolle spielen. / Due to the severe immune suppression induced during acute measles, infected children are highly susceptible to secondary infections. In contrast to vaccination, only infection with wildtype measles virus (MV) leads to clinically relevant immune suppression. After mitogen stimulation, isolated peripheral blood lymphocytes (PBL) of MV infected patients show a significant reduction of proliferation ex vivo which is used as a parameter for immune suppression. There is some evidence that the inhibition of lymphocyte proliferation is induced by the glycoproteins fusion protein (F) and hemagglutinin (H). However, the underlying mechanisms are not fully understood. The aim of this project was to analyze the influence of MV glycoproteins H and F on MV induced immune suppression. In order to investigate the immune suppressive effect of F and H in a genetically and immunologically well characterized animal model, a novel transgenic mouse model was established. In this transgenic mouse the MV wildtype glycoproteins which are responsible for the immune suppression were conditionally expressed in a tissue specific and tetracycline-regulated manner (tet-system). Using microinjection, a remarkably small number of transgenic mice was produced. 780 microinjections resulted in only four transgenic mice containing F and H under the control of a transactivator-dependent bidirectional promoter in their genome. This was a first hint at a strong selection against the expression of F and H in the transgenic animal model. The various mouse lines were fully characterized. To detect single copies of the transgene, a highly sensitive PCR and southern blot were established. It could be shown that one of the four mouse lines contained a single copy of the transgene, whereas the three remaining lines had approximately 10 copies in a tandemarrangement in the genome. In addition, southern blotting revealed that the integration of the transgenes had occurred at a single location in the genome. Presumably, the small number of transgenic mice was due to leaky expression of F and H during embryogenesis which in consequence lead to animals with a strong control of the expression of the transgene. This is in line with the result that none of the four transgenic mouse lines showed a residual expression of F and H. Of the four lines obtained, one line bred insufficiently well to obtain a homozygous line possibly due to an insertion mutant. The remaining three lines were crossed with an inducer mouse which expressed the tetracycline-responsive transactivator in a T cell specific manner as to produce double-transgenic mice with tetracyclineregulated expression of F and H in T cells. Expression analysis revealed that the transgene was silent in two double-transgenic lines. In the remaining line, the transcription of F- and H-mRNA in spleen (in vitro) and thymus (in vitro and in vivo, respectively) could be detected. However, protein expression was rather weak and H protein was found in the thymus of only one animal. In summary, these observations hint at a strong selection against an expression of F and H. In these mice the effect of the expression of F and H were investigated. In some of the double-transgenic mice of the inducible line, a weak MV specific B and T cell response could be detected. However, no immune suppression was induced and no decrease in the number of thymocytes was observed. Furthermore, even in the context of a long-term expression of F and H over a period of 23 weeks, no cumulative immune suppressive effects could be detected after infection with a murine leukemia virus. This is appears to be a result of the weak expression of the MV glycoproteins F and H due to their toxic effect in vivo. Apparently, in this mouse model the toxic effect of MV glycoprotein expression downregulated the expression of these proteins. Thus it might be that this toxic effect may be important in the context of MV induced immune suppression.

5.1 Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden Tumore bestehen nicht nur aus Tumorzellen, sondern auch aus der sie umgebenden extrazellulären Matrix (EZM), und Stromazellen wie Fibroblasten (cancer-associated fibroblast; CAF) und Endothelzellen (tumor endothelial cell; TEC). Diese Stromazellen haben durch die Ausschüttung von Zytokinen, proteolytischen Enzymen, Wachstums- und Angiogenesefaktoren einen entscheidenden Einfluss auf die Tumorprogression. Sie unterscheiden sich von den Stromazellen der normalen Gewebe durch die Expression von sogenannten Tumorstroma-assoziierten Antigenen (TSAA). Damit sollten Therapien, die auf TSAA abzielen, universell einsetzbar und weniger anfällig gegenüber Resistenzentwicklungen (immune escape Mechanismen) sein, da Stromazellen im Gegensatz zu neoplastischen Zellen genetisch relativ stabil sind. Für eine Immuntherapie mit vom Tumorstroma abgeleiteten Peptiden wählten wir die TSAA Endoglin und Fap, welche während der Wundheilung und im Tumorstroma induziert werden. Dabei sollte überprüft werden, ob prophylaktische Vakzinierungen in C57Bl/6j Mäusen Peptid-reaktive T-Zellen induzieren können, und das Wachstum von transplantieren Grm1-transgenen Tumoren reduziert werden kann. In der Tat konnten wir sowohl bei Endoglin- als auch bei Fap Peptid vakzinierten Tieren in vivo Peptid-reaktive Lymphozyten im Blut und zu einem geringeren Anteil auch in der Milz nachweisen, welche Peptid-gepulste syngene Milzzellen lysieren konnten. Allerdings konnte in beiden Fällen keine Reduktion des Tumorwachstums gegenüber der Kontrollgruppe beobachtet werden. Bei der Fap-Peptid-vakzinierten Gruppe war das Tumorwachstum gegenüber der Kontrollgruppe sogar gesteigert. Dies könnte darauf hindeuten, dass die Induktion Fap-Peptid-reaktiver T-Zellen tumorpromovierend wirkt. Möglicherweise könnte aber durch eine Modifikation des Vakzinierungsprotokolls bzw. durch eine Kombination mit anderen Immuntherapeutika ein verbessertes Ansprechen auf eine Endoglin bzw. Fap basierte Immuntherapie erzielt werden. 5.2 Immunsuppressive Mechanismen im Grm1-transgenen Melanom-Modell Grm1-transgene Mäuse entwickeln spontan kutane Melanome. Dieses Modell erlaubte es uns in der vorliegenden Arbeit spontane Immunantworten im Laufe der Melanomentstehung zu untersuchen. Hierfür analysierten wir sowohl ex vivo als auch in vitro aus Milz und Lymphknoten gewonnene Lymphozyten von Mäusen, welche keine Tumorläsionen bzw. eine niedrige oder hohe Tumorlast aufwiesen. Dabei konnten wir ex vivo einen Anstieg der Frequenz aktivierter CD4+ und CD8+ Lymphozyten mit zunehmender Tumorlast zeigen. Bei tumortragenden Tieren exprimierten jedoch hauptsächlich CD4+ T-Zellen Aktivierungsmarker nach in vitro Stimulation. Interessanterweise waren diese Zellen tumortragender Tiere auch funktionell beeinträchtigt, was sich in einer verminderten Proliferationskapazität nach in vitro Stimulation zeigte. Weitere Analysen ergaben, dass die erhöhte Frequenz regulatorischer T Zellen bei tumortragenden Tieren ein frühes Ereignis im Laufe der Tumorentstehung ist. Gleichzeitig konnte auch ein starker Anstieg der immunsupprimierenden Zytokine Tgf-β1 und Il-10 sowohl in den Lymphknoten als auch im Tumorgewebe beobachtet werden. Dabei war die Tgf-β1-Expression sowohl im Tumor als auch im tumor-drainierenden Lymphknoten erhöht, während Il-10 im Tumor nur moderat exprimiert wurde, was eine komplexere Regulation der Il-10-Expression nahe legt. Dies bedeutet, dass in Grm1-transgenen Mäusen ähnlich wie auch bei Melanompatienten zelluläre und zytokinabhängige Mechanismen zur Tumorentstehung beitragen und dieses Modell daher geeignet ist, um präklinisch immunmodulierende Therapieansätze zu testen. / 6.1 Immunotherapy with peptides derived from tumor stroma-associated antigens Tumors do not only comprise tumor cells but also stromal cells like fibroblasts (cancer associated fibroblast; CAF) and endothelial cells (tumor endothelial cell; TEC) and the surrounding extracellular matrix (ECM). These stromal cells impact on progression and invasion of tumors through release of cytokines, ECM-degrading enzymes, growth factors, and angiogenic factors. They differ from their normal counterparts through expression of so called tumor stroma-associated antigens (TSAA). Therefore, therapies targeting the tumor stroma should be universally applicable. Furthermore, such therapies should be less prone to resistance mechanisms as stromal cells are genetically more stable than neoplastic cells. We selected the TSAA Endoglin and Fap, which are both specifically induced during wound healing and in the tumor stroma, to test if vaccination with peptides derived from these TSAA induced peptide-reactive T cells, and could reduce the growth of transplanted Grm1 transgenic tumors in C57Bl/6j mice in a prophylactic setting. In mice vaccinated with Endoglin- and Fap-peptides, respectively, peptide-reactive lymphocytes from peripheral blood and spleen were able to lyse peptide-loaded syngeneic splenocytes in vivo. However, vaccination with Endoglin- and Fap-peptides, respectively, did not affect the growth of transplanted Grm1-transgenic tumors. In fact, tumor growth was enhanced in Fap peptide vaccinated mice compared to the control group. This suggests that Fap peptide reactive T cells promote tumor progression. Modification of the vaccination protocol or a combination with an immune-modulatory therapy could, however, increase the efficacy of an anti-Endoglin or anti-Fap therapy, respectively. 6.2 Immunosuppressive mechanisms of Grm1-transgenic murine melanoma Grm1-transgenic mice spontaneously develop cutaneous melanoma. This model allowed us to scrutinize the generic immune responses over the course of melanoma development. To this end, lymphocytes obtained from spleens, unrelated lymph nodes and tumor-draining lymph nodes of mice with no evidence of disease, low or high tumor burden were analyzed ex vivo and in vitro. Thereby, we could demonstrate an increased frequency of activated CD4+ and CD8+ T lymphocytes in the respective organs with increasing tumor burden. However, mainly CD4+ T cells, which could constitute both T helper as well as immune suppressive regulatory T cells, but not CD8+ T cells expressed activation markers upon in vitro stimulation when obtained from tumor-bearing mice. Interestingly, these cells from tumor-burdened animals were also functionally hampered in their proliferative response when subjected to strong in vitro stimulation. Further analyses revealed that the increased frequency of regulatory T cells in tumor-bearing mice is an early event present in all lymphoid organs. Additionally, expression of the immunosuppressive cytokines Tgf-β1 and Il-10 became more evident with increased tumor burden. Notably, Tgf-β1 is strongly expressed in both the tumor and the tumor-draining lymph node, whereas Il-10 expression is more pronounced in the lymph node, suggesting a more complex regulation of Il-10. Thus, similar to the situation in melanoma patients both cytokines as well as cellular immune escape mechanisms seem to contribute to the observed immune suppressed state of tumor-bearing Grm1-transgenic mice, suggesting that this model is suitable for preclinical testing of immune-modulatory therapies.

Eierstockkrebs ist der Tumor mit der schlechtesten Heilungsprognose unter allen gynäkologischen Malignomen. Allein in Deutschland verursacht er über 6000 Tote pro Jahr. Patienten mit Ovarialkarzinom zeigen erst in einem sehr fortgeschrittenen Stadium charakteristische Symptome. Die einzig möglichen Behandlungsmethoden sind dann die operative Tumorentfernung und die Verabreichung von platinbasierter Chemotherapien sowie von Anthrazyklinen. Da die aktuelle 5-Jahres-Überlebensrate lediglich 20-40% beträgt, besteht ein dringender Bedarf an neuen therapeutischen Optionen. Seit herausgefunden wurde, dass immunologische Parameter das Überleben der Patienten beeinflussen, ist Immuntherapie zu einer der vielversprechendsten Behandlungsarten des Eierstockkrebs geworden. Das Ziel unserer Forschung ist die Überwindung der Immunevasion des Tumors durch ein Verhindern der immun-unterdrückenden Mechanismen des Tumors. Im Speziellen befasst sich diese Arbeit mit dem Einfluss von Adenosin, das durch die Ectonukleotidasen CD39 und CD73 in der Mikroumgebung des Tumors gebildet wird. Die CD39- und CD73-Expression der Zellen führt zu Immunosuppression da diese Ectonukleotidasen immun-stimulierendes, extrazelluläres ATP in immunsuppressives Adenosin umwandeln. Dies wurde zuerst als Effektormechanismus für regulatorische T-Zellen beschrieben, kann aber auch im Tumormikromilieu von Bedeutung sein. Mit dem Wissen, dass Tumorzellen von Eierstockkrebs-Patientinnen große Mengen der ATP-unterdrückenden Ectonukleotidasen CD39 und CD73 bilden, analysierten wir die adenosinvermittelte Unterdrückendung von Immunantwortenin der Mikroumgebung der Tumorzellen. Im Vergleich zu regulatorischen T Zellen konnten wir bei Eierstockkrebs-Zelllinien und bei aus Aszites gewonnenen Krebszellen eine 30- bis 60-fache Adenosinproduktion messen. Um diesen mutmaßlichen Immunevasions-Mechanismus zu bestätigen, untersuchten wir seine Auswirkungen auf mehrere Immunzellenpopulationen. CSFE-basierte Experimente zeigten zum Beispiel eine Hemmung der CD4+ T-Zell-Proliferation durch Adenosin, welches von Eierstockkrebs-Zellen produziert wurde. In diesem Zusammenhang haben wir auch eine in-vitro Methode entwickelt, mit der wir die Beeinflussung von Makrophagen durch Eierstockkrebszellen analysieren und modulieren konnten. Neben seiner suppressiven Wirkung übt Adenosin auch chemotaktische Effekte auf menschliche Monozyten aus und lockt wahrscheinlich myeloide Vorläuferzellen zum Tumorgewebe. Anschließend differenzieren sich menschliche Monozyten in einer von Eierstockkrebszellen geformten Mikroumgebung zu M2 Makrophagen oder tumor-assoziierten Makrophagen (TAMs), die ihrerseits erhebliche Mengen der Adenosin-produzierenden Ectonukleotidasen CD39 und CD73 bilden. Während wir die Regulierung der Ectonukleotidasen-Expression untersuchten, entdeckten wir auch, dass klinisch genutzte Techniken zur Behandlung von Eierstockkrebs (zum Beispiel die Anwendung von Doxorubicin oder Bestrahlung) in vitro das CD73- und CD39-Level von Eierstockkrebs- und Immunzellen beeinflussen. In dieser Studie zeigen wir, wie dieser behandlungsbedingte Wechsel des ATP/Adenosine-Verhältnisses die Effektorfunktion verschiedener Immunzellen moduliert. Darüber hinaus untersuchen wir den potentiellen Vorteil von klinisch verfügbaren, niedermolekularen Inhibitoren für CD39 und CD73, die die Immunsuppression in der Mikroumgebung des Tumors partiell aufheben könnten, und die vor allem in Kombination mit gängigen Behandlungsschemata von großem Interesse sein könnten. / Ovarian cancer (OvCa) is the tumor with the most unfavourable prognosis among all gynaecological malignancies causing more than 6000 deaths per year in Germany alone. Patients with OvCa show symptoms at very advanced stages of tumor progression when the only available treatments consist on tumor debulking surgery and administration of platinum based chemotherapeutics and anthracyclins. There is an urgent need to develop new therapeutical strategies since the actual 5 year survival rate of OvCa patients does not exceed 20-40%. Immunotherapy is a promising approach for treatment of ovarian cancer, since it has been observed that immunological parameters can influence the outcome of the patient. The aim of our research is to overcome tumor immune escape by counteracting the immunosuppressive mechanisms developed by the tumor. In particular, this work studies the influence of adenosine generated by the ectonucleotidases CD39 and CD73 in the tumor microenvironment. Cellular expression of CD39 and CD73 contributes to immunosupression as these ectonucleotidases convert immune-stimulatory extracellular ATP into immunosuppressive adenosine. This was primarily described as effector mechanism for regulatory T cells, but may also be important in the tumor microenvironment. Having found that tumor cells from OvCa-patients express high levels of ATP-depleting ectonucleotidases CD39 and CD73 we set out to investigate a potential immunosuppressive mechanism via adenosine production in the tumor microenvironment. We could measure 30-60 times higher adenosine production by OvCa cell lines and ascites-derived cancer cells as compared to physiological normal conditions. To confirm this putative immune escape mechanism we investigated its effect on several immune cell populations. CFSE-based assays, for example, showed an inhibition of CD4+ T cell proliferation by OvCA cell-derived adenosine. In this context, we have further established an in-vitro assay, where OvCa cells modulate the function of macrophages towards a M2 or tumor associated (TAM) phenotype. Together with the phenotype modulation adenosine exerts chemotactic effects on human monocytes and is thus likely to attract myeloid precursor cells towards the tumor tissue. Moreover, in a microenvironment that is shaped by OvCa cells, human monocytes differentiate into M2 macrophages or TAMs which themselves express significant levels of the adenosine-generating ectonucleotidases CD39 and CD73. Investigating the regulation of ectonucleotidase expression, we also observed that approaches clinically used to treat OvCa (namely application of doxorubicine or irradiation) influence CD73 and CD39 levels of OvCa and immune cells in vitro. In this study we show how this treatment-induced change in the ATP/adenosine ratio modulates the effector function of different immune cells. Furthermore, we investigate the potential benefit of clinically available small molecule inhibitors for CD39 and CD73 that could relieve immunosuppression in the tumor microenvironment especially in combination with common treatment regimes.

Eine Masernvirus- (MV) Infektion induziert eine effiziente virus-spezifische Immunantwort. Aber parallel erfolgt eine generelle Suppression immunologischer Funktionen, die sekundäre Infektionen ermöglichen und verstärken kann. Eine Lymphopenie und die ex vivo beobachtete stark verminderte proliferative Antwort peripherer Lymphozyten auf polyklonale oder antigenspezifische Aktivierung gilt als zentraler Befund für diese Immunsuppression. Bislang konnte in vitro keine Interferenz mit dem von den MV-Glykoproteinen generierten negativen Proliferationssignal nachgewiesen werden. Die in der vorliegenden Arbeit dargestellten Befunde zeigen jedoch, daß der MV induzierte Proliferationsarrest unter bestimmten Bedingungen in IPP/IL-2 (Isopentenylpyrophosphat und Interleukin-2) stimulierten gd T Zellen aufgehoben werden kann. Die Sensitivität der gd T Zellen gegenüber dem von den MV-Glykoproteinen vermittelten Signal gleicht der der konventionellen T Zellen. Dennoch reicht der Kontakt zu Monozyten und mit dem MV Vakzinestamm Edmonston (ED)-infizierten B Zellen oder dendritischen Zellen (DC) aus, eine ungehemmte Expansion der g9d2 T Zellen zu induzieren. Durch eine Interaktion mit ED-infizierten B Zellen und DC reagieren Monozyten wahrscheinlich mit einer Regulation stimulatorischer oder inhibitorischer Oberflächenmoleküle, die bei dem Kontakt mit gd T Zellen einen additiven Stimulus liefert, der das negative Proliferationssignal von MV neutralisiert. Auch Funktionen antigenpräsentierender Zellen (APC) scheinen differentiell durch MV-Stämme regulierbar zu sein. Die Erkennung von molekularen Mustern von Pathogenen über die Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR) ist eine wichtiger Schritt bei der Aktivierung einer Immunantwort durch APCs. Nachdem die Fähigkeit, mikrobieller Produkte APC über TLRs zu aktivieren, dokumentiert ist, sind nur zwei virale Proteine bekannt, die mit TLR4 interagieren. Mithilfe transgener Reporterzellen konnte demonstriert werden, daß MV-Wildtypstämme, nicht aber Vakzinestämme humanes und murines TLR2, wahrscheinlich mit CD14 als Korezeptor, und nicht TLR4, aktivieren. Die TLR2 agonistische Eigenschaft konnte dem MV-Wildtyp Hämagglutininprotein (H) zugeordnet werden. Der Austausch einer einzigen Aminosäure im WTF-H, Asparagin zu Tyrosin an der Positon 481, welche in an CD46 adaptierten Vakzinestämmen zu finden ist, reichte für den Verlust TLR agonistischer Aktivität aus. Auch in humanen Monozyten konnten Viren, die das authentische WTF-H Protein enthielten, die Expression TLR responsiver Gene wie IL-6 induzieren. Gleichzeitig verursachte die Aktivierung der Monozyten durch die TLR Agonisten, einschließlich der Wildtyp MV, die Expression des allgemeinen MV Rezeptors CD150, der von ruhenden Monozyten nicht exprimiert wird. Die Spezifität der WTF-H und TLR2 Interaktion konnte durch blockierende Antikörper und TLR2-/- Mäuse, die kein IL-6 nach Stimulation mit WTF freisetzen, gezeigt werden. Die Fähigkeit von MV-Wildtypstämmen TLR2 zu aktivieren, könnte wesentlich zu der Immunaktivierung, aber auch zur Ausbreitung und Pathogenese der Infektion beitragen und die Attenuierung von Vakzinestämmen erklären. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit Hinweise auf eine MV-stammspezifische Aktivierung angeborener Immunantworten, welche die adaptive Immunität modulieren können. / Measles virus (MV) infection induces an efficient virus-specific immune response, but also a general suppression of immune functions, which favors and aggravates secondary infections. Lymphopenia and a diminished expansion of polyclonal or antigen-specific stimulated lymphocytes ex vivo are hallmarks of the immunosuppression. No interference with the negative signal of the MV-glycoprotein complex could be observed in vitro as yet. The results of the present study, however, show that gd T cells are –under specific conditions- refractory towards the immunosuppressive signal of the MV glycoproteins. While the sensitivity of gd T cells against the MV-mediated signal is comparable to ab T cells, the contact between ED-infected B cells and dendritic cells (DC) and monocytes is necessary and sufficient to neutralize this negative signal and to allow the IPP/IL-2 (isopentenylpyrophosphyte and interleukin 2) dependent expansion of gd T cells. Most likely, the interaction with the MV vaccine strain Edmonston (ED) infected B cells or DC with monocytes modulates the expression of costimulatory or inhibitory surface molecules, which efficiently compensate the inhibitory MV signal. As the immunostimulatory and inhibitory responses differ between natural infection and vaccination, a differential regulation of APC activation and function might be central for both processes. While the ability of microbial products to activate antigenpresenting cells (APC) via Toll-like receptors (TLR) is well established, triggering of TLR4 signaling by viruses is confined to the RSV Fusion protein and the envelope protein of murine retroviruses as yet. Using transgenic CHO cells, we found that MV wildtype, but not vaccine strains were able to activate TLR2, but not TLR4, most likely in the context of CD14. This property was dependent on the expression of the hemagglutinin (H) protein of the MV wildtype strain, WTF, and could be abrogated by a single amino acid exchange within the H-protein, found in attenuated virus strains. Importantly, in human monocytes particularly the MV wildtype strain efficiently induced the activation of TLR-responsive genes including IL-6 and also the surface expression of the common MV receptor, CD150. As peripheral blood monocytes normally do not express CD150, MV triggers the expression of ist receptor and thereby probably enhances infection and viral spread. By comparing TLR2- deficient to wild-type mice we could proof the unique involvement of TLR2. Thus, activation of TLR-signaling by wildtype MV H-protein may essentially contribute to the immune activation during acute measles. Differential interaction of MV wildtype and vaccine strains with APC provides a novel explanation for the attenuated immune responses after vaccination. On the other hand, MV-strain dependent desensitization of TLR activation, as described for microbial products, may essentially contribute to the impairment of APC functions towards opportunistic infections. Altogether the results of the present study provide suggestions how a MV-strain dependent activation of innate immune responses might occur, to modulate adaptive immunity.

Aachen, Techn. Hochsch., Thesis (doctoral), 2001.

Ulm, Univ., Diss., 2007.