Hintergrund: Die ambulant erworbene Pneumonie (CAP) ist bei Patienten mit schwerer Immunsuppression häufig und mit einer schlechten Prognose assoziiert. Scores zur Risikoprädiktion bei Sepsis oder CAP sind bei diesen Patienten kaum untersucht. Fragestellung: Ziel der Studie war die Evaluation der prognostischen Prädiktion der qSOFA- und CRB-65-Scores bei Patienten mit Pneumonie und schwerer Immunsuppression. Methoden: Es handelt sich um eine retrospektive Kohortenstudie am Uniklinikum Dresden zwischen 2014 und 2017 mit Einschluss konsekutiver Patienten mit CAP und schwerer Immunsuppression (u.a. Neutropenie, aktive hämatologische Neoplasie, Z.n. allogener Stammzell- oder Organtransplantation, HIV–Infektion mit CD4-Zellen < 200/µl, zytostatische oder rheumatologische immunsuppressive Therapie innerhalb der letzten 3 Monate, Prednisolon-Äquivalent >10mg/d > 3 Monate). Patienten mit dokumentierter Therapielimitation oder direkter Aufnahme auf die Intensivstation wurden ausgeschlossen. Die CRB-65- und qSOFA-Kriterien wurden bei Erstvorstellung dokumentiert. Der primäre Endpunkt war definiert als Notwendigkeit mechanischer Beatmung oder von Vasopressoren (MVVS) und/oder Krankenhausletalität. Um die prognostischen Eigenschaften der Scores, der einzelnen Score- Parameter, sowie der darüber hinaus erhobenen Parameter zu untersuchen, wurden univariate und multivariate Regressionsanalysen sowie ROC-Kurvenanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Von 198 eingeschlossenen Patienten erfüllten 41 (21%) den primären Endpunkt, 19 (10%) verstarben. Das Alter war kein unabhängiger Prädiktor, dagegen waren sowohl der CRB- als auch der qSOFA-Score in der Kaplan-Meier-Analyse sowie in der multivariaten Analyse unabhängig von anderen Prädiktoren mit dem primären Endpunkt assoziiert (jeweils p < 0.001). In der ROC-Analyse erreichten beide Scores eine moderate Prädiktion (AUC 0,70 bzw. 0,69), bei 0 vorliegenden Kriterien zeigte sich ein NPV von jeweils 89% (13/120 bzw. 12/105 Patienten „übersehen“). Bei ≥ 2 Kriterien resultierten PPVs von 44 bzw. 58%. Diskussion: Sowohl die CRB- als auch die qSOFA-Kriterien zeigten eine moderate, aber signifikante prognostische Aussagekraft. Das Alter ist dagegen in dieser Population kein geeigneter prädiktiver Parameter. Auch bei den Scores ohne Alterskriterium ist der NPV jedoch nicht ausreichend zum Ausschluss von Komplikationen. Daher sollten alle schwer immunsupprimierten Patienten mit Pneumonie zumindest initial stationär, bei > 1 positivem Score-Kriterium auch intensiv hinsichtlich einer akuten Organdysfunktion, überwacht werden.:ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VI ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS VIII 1 EINLEITUNG 1 1.1 DIE AMBULANT ERWORBENE PNEUMONIE 1 1.1.1 Definition und Einteilung 1 1.1.2 Epidemiologie 2 1.1.3 Diagnosestellung 3 1.1.4 Erregerspektrum bei CAP ohne Immunsuppression 4 1.1.5 Therapie der CAP ohne Immunsuppression 5 1.1.6 Verlauf, klinische Stabilitätskriterien und Therapiedauer 6 1.2 RISIKOSTRATIFIZIERUNG DER CAP OHNE IMMUNSUPPRESSION 7 1.2.1 Bedeutung der korrekten und schnellen Risikostratifizierung 7 1.2.2 Risikostratifizierung der CAP ohne Immunsuppression 8 1.2.3 Aktuelle Studien zur Risikostratifizierung mittels CRB-65/qSOFA 13 1.3 CAP BEI IMMUNSUPPRESSION 15 1.3.1 Aufbau des Immunsystems 15 1.3.2 Immunsuppression 16 1.3.3 Ursachen der Immunsuppression 17 1.3.4 Bedeutung der CAP bei Immunsuppression 19 1.3.5 Verändertes Erregerspektrum und Therapie bei CAP-Patienten mit Immunsuppression 20 1.3.6 Risikostratifizierung bei CAP und Immunsuppression 23 1.4 RATIONALE UND STUDIENZIEL 26 2 METHODEN 28 2.1 ÜBERBLICK 28 2.2 STUDIENDESIGN 28 2.3 SELEKTION DER STUDIENPOPULATION 28 2.3.1 Datenbasis 28 2.3.2 Einschlusskriterien 29 2.3.3 Ausschlusskriterien 30 2.3.4 Studienpopulation 31 2.4 ENDPUNKTE 33 2.5 DATENERFASSUNG 33 2.5.1 Erhobene Parameter 33 2.5.2 Berechnete Scores und Parameter 34 2.6 FALLZAHLSCHÄTZUNG 34 2.7 STATISTISCHE ANALYSE 34 3 ERGEBNISSE 36 3.1 PATIENTENCHARAKTERISTIKA 36 3.2 MIKROBIOLOGIE 39 3.3 UNIVARIATE ANALYSEN 41 3.3.1 Primärer Endpunkt 41 3.3.2 Sekundärer Endpunkt 45 3.4 MULTIVARIATE ANALYSEN 48 3.5 KAPLAN-MEIER-ANALYSE 54 3.6 ROC-KURVENANALYSE FÜR QSOFA-, CRB-65-, QSOFA-65- UND CRB- SCORE 56 4 DISKUSSION 61 4.1 WICHTIGSTE ERGEBNISSE DER ARBEIT 61 4.2 REPRÄSENTATIVITÄT DER PATIENTENKOHORTE 61 4.2.1 Patientencharakteristika 61 4.2.2 Mikrobiologie 65 4.2.3 Endpunkte 66 4.3 PRÄDIKTIVE PARAMETER 67 4.3.1 CRB-65-Einzelkriterien und -Score 67 4.3.2 qSOFA-Einzelkriterien und -Score 69 4.3.3 Neuer Score 70 4.3.4 qSOFA-Score und CRB-65-Score im direkten Vergleich 70 4.3.5 Komorbiditäten 71 4.3.6 Laborchemische Prognoseparameter 72 4.3.7 Weitere Prognoseparameter 73 4.4 LIMITATIONEN 75 4.5 SCHLUSSFOLGERUNG UND KLINISCHE BEDEUTUNG 75 4.6 AUSBLICK 77 5 ZUSAMMENFASSUNG 78 6 SUMMARY 79 7 LITERATURVERZEICHNIS 80 8 ANHANG 93 9 DANKSAGUNG 101 10 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 102 / Background: Community-acquired pneumonia (CAP) in immunocompromised patients is a common issue and often associated with poor prognosis. Scores for risk prediction used in immunocompetent patients with sepsis or CAP are poorly evaluated for these patients. Aim: The purpose of the study was to evaluate the prognostic value of the qSOFA- and CRB-65-criteria for risk stratification of immunocompromised patients with CAP. Methods: The retrospective cohort study including 198 consecutive patients hospitalized in the university hospital of Dresden with CAP and severe immunosuppression (neutropenia, active haematological neoplasia, stem cell transplantation, solid organ transplantation, HIV-infection with CD4-cells < 200/µl, immunosuppressive treatment within the last 3 months, prednisolone equivalent > 10 mg/d > 3 months) was conducted between 2014 and 2017. Patients that were admitted directly to the intensive care unit and those with treatment restrictions were excluded. The CRB- and qSOFA-criteria were documented when patients entered the emergency department. Primary outcome was defined as need of mechanical ventilation (MV) or vasopressor support (VS) and/or hospital-mortality. Univariate and multivariate regression analysis as well as ROC curve analysis were performed to investigate the prognostic properties of all scores, the single score parameters and other predictive parameters. Results: 41 (21 %) of 198 included patients reached the primary endpoint and 19 (10 %) of the patients died. Age was not an independent predictive parameter. Using Kaplan-Meier and multivariate logistic regression analysis, both the CRB- and qSOFA-scores were independently associated with the primary endpoint (each p < 0,001). However, after ROC curve analysis both scores only showed moderate prediction (AUC 0,70 and 0,69). With a score of 0, the negative predictive value (NVP) was about 89% in both scores (13/120 and 12/105 missed patients, respectively). When 2 or more parameters were positive the positive predictive values (PPV) were 44 and 58%, respectively. Conclusion: Both, the qSOFA as well as the CRB score, showed moderate but significant prognostic properties. In this population, age was an inappropriate predictive parameter. Even without the age criterion the NPV was inadequate to exclude the possibility of organ failure and complications. Therefore, all immunocompromised patients, especially those with a score > 1, should be monitored intensively concerning organ failure when having a CAP.:ABBILDUNGSVERZEICHNIS V TABELLENVERZEICHNIS VI ABKÜRZUNGS- UND SYMBOLVERZEICHNIS VIII 1 EINLEITUNG 1 1.1 DIE AMBULANT ERWORBENE PNEUMONIE 1 1.1.1 Definition und Einteilung 1 1.1.2 Epidemiologie 2 1.1.3 Diagnosestellung 3 1.1.4 Erregerspektrum bei CAP ohne Immunsuppression 4 1.1.5 Therapie der CAP ohne Immunsuppression 5 1.1.6 Verlauf, klinische Stabilitätskriterien und Therapiedauer 6 1.2 RISIKOSTRATIFIZIERUNG DER CAP OHNE IMMUNSUPPRESSION 7 1.2.1 Bedeutung der korrekten und schnellen Risikostratifizierung 7 1.2.2 Risikostratifizierung der CAP ohne Immunsuppression 8 1.2.3 Aktuelle Studien zur Risikostratifizierung mittels CRB-65/qSOFA 13 1.3 CAP BEI IMMUNSUPPRESSION 15 1.3.1 Aufbau des Immunsystems 15 1.3.2 Immunsuppression 16 1.3.3 Ursachen der Immunsuppression 17 1.3.4 Bedeutung der CAP bei Immunsuppression 19 1.3.5 Verändertes Erregerspektrum und Therapie bei CAP-Patienten mit Immunsuppression 20 1.3.6 Risikostratifizierung bei CAP und Immunsuppression 23 1.4 RATIONALE UND STUDIENZIEL 26 2 METHODEN 28 2.1 ÜBERBLICK 28 2.2 STUDIENDESIGN 28 2.3 SELEKTION DER STUDIENPOPULATION 28 2.3.1 Datenbasis 28 2.3.2 Einschlusskriterien 29 2.3.3 Ausschlusskriterien 30 2.3.4 Studienpopulation 31 2.4 ENDPUNKTE 33 2.5 DATENERFASSUNG 33 2.5.1 Erhobene Parameter 33 2.5.2 Berechnete Scores und Parameter 34 2.6 FALLZAHLSCHÄTZUNG 34 2.7 STATISTISCHE ANALYSE 34 3 ERGEBNISSE 36 3.1 PATIENTENCHARAKTERISTIKA 36 3.2 MIKROBIOLOGIE 39 3.3 UNIVARIATE ANALYSEN 41 3.3.1 Primärer Endpunkt 41 3.3.2 Sekundärer Endpunkt 45 3.4 MULTIVARIATE ANALYSEN 48 3.5 KAPLAN-MEIER-ANALYSE 54 3.6 ROC-KURVENANALYSE FÜR QSOFA-, CRB-65-, QSOFA-65- UND CRB- SCORE 56 4 DISKUSSION 61 4.1 WICHTIGSTE ERGEBNISSE DER ARBEIT 61 4.2 REPRÄSENTATIVITÄT DER PATIENTENKOHORTE 61 4.2.1 Patientencharakteristika 61 4.2.2 Mikrobiologie 65 4.2.3 Endpunkte 66 4.3 PRÄDIKTIVE PARAMETER 67 4.3.1 CRB-65-Einzelkriterien und -Score 67 4.3.2 qSOFA-Einzelkriterien und -Score 69 4.3.3 Neuer Score 70 4.3.4 qSOFA-Score und CRB-65-Score im direkten Vergleich 70 4.3.5 Komorbiditäten 71 4.3.6 Laborchemische Prognoseparameter 72 4.3.7 Weitere Prognoseparameter 73 4.4 LIMITATIONEN 75 4.5 SCHLUSSFOLGERUNG UND KLINISCHE BEDEUTUNG 75 4.6 AUSBLICK 77 5 ZUSAMMENFASSUNG 78 6 SUMMARY 79 7 LITERATURVERZEICHNIS 80 8 ANHANG 93 9 DANKSAGUNG 101 10 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG 102

Hintergrund: Patienten mit chronischen entzündlichen Erkrankungen sind aufgrund ihrer Grundkrankheit, aber auch durch die häufig notwendige immunsuppressive Therapie gefährdet, an einer impfpräventablen Infektionskrankheit zu erkranken. In einer Stichprobe sollte der Impfstand bei Patienten mit chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) erhoben werden. Besondere Beachtung galt Vorbehalten der Patienten gegen die empfohlenen Schutzimpfungen. Methoden: Wir baten 203 Patienten mit CED (davon 57% Mb. Crohn, 63% weiblich; medianes Alter 36 Jahre), die im letzten Jahr keine Impfberatung erhalten hatten, einen Fragebogen mit 38 Fragen zu beantworten. Zudem wurden alle Impfnachweise erfasst und mit den aktuellen Empfehlungen der Ständigen Impfkommission abgeglichen. Die Befragung erfolgte vom 1.4. bis 30.9.2009. Ergebnisse: Nur 83% der Patienten hatten einen Impfausweis. Es fanden sich erhebliche Impfdefizite; so wurden in den letzten zehn Jahren nur 67% der Patienten gegen Tetanus und 21% gegen Pertussis geimpft, 28% nahmen die Impfung gegen die saisonale Grippe 2008 wahr und nur 9% wurden jemals gegen Pneumokokken geimpft. Im Subgruppenvergleich von Patienten mit TNF-Blockern (n=39) mit denjenigen Patienten, die noch nie eine immunsuppressive Dauertherapie erhielten (n=67), zeigten sich keine Unterschiede. 80% der Patienten wären bereit, alle offiziell empfohlenen Schutzimpfungen durchführen zu lassen. 22% aller Patienten gaben an, Schutzimpfungen zu vermeiden, weil sie Nebenwirkungen befürchteten, 15% weil das Immunsystem „nicht intakt“ ist und 9% befürchten eine Verschlimmerung der CED durch eine Impfung. Schlussfolgerungen: Der Impfstand in der untersuchten Stichprobe war unzureichend. Es fand sich insbesondere eine deutliche Diskrepanz zwischen der hohen Bereitschaft der Patienten, Schutzimpfungen durchführen zu lassen, und dem tatsächlichen Impfstand. Unsere Daten legen die Notwendigkeit einer erhöhten ärztlicher Wachsamkeit für Impflücken bei immunsuppressiv behandelten Patienten nahe. / Background: Patients with chronic inflammatory diseases are at increased risk for vaccine preventable infectious diseases. This is caused by the inflammatory state itself as well as often necessary immunosuppressive therapy. In a random sample, we investigated whether patients with inflammatory bowel disease (IBD) are sufficiently vaccinated. Special attention was spent to arguments for vaccine refusal. Methods: Between 1.4.2009 and 30.9.2009, we asked 203 consecutive IBD patients (thereof 57% Crohn’s disease, 63% female; median age 36 years), who got no vaccination advise within the last year to answer a questionnaire with 38 questions. As well, the vaccination cards were adjusted with the official recommendations. Results: Only 83% of patients had a vaccination card. We recognized substantial vaccination deficiencies. Within the past 10 years, only 67% of patients had tetanus and 21% had pertussis vaccination. Only 28% had an influenza vaccination in 2008 and only 9% were ever immunized against pneumococcus. A subgroup analysis of patients with TNF-blockers (n=39) with patients, who never had immunosuppressive therapy (n=67) revealed no difference. 80% of all patients are willing to adhere to all officially recommended vaccinations. 22% and 15% of patients stated that they avoid vaccinations as they afraid side effects or as they assess their immune system as not intact. Nine per cent feared a worsening of IBD after vaccination. Conclusions: In this random sample, the adherence to vaccination recommendations was low. We observed a marked difference between the willingness of IBD patients for immunizations and the realized vaccinations. Our data suggest that an increased medical awareness for vaccination deficiencies in immunosuppressed patients is mandatory.

Einleitung: CTLA-4Ig blockiert CD28-vermittelte co-stimulatorische Signale und inhibiert kompetitiv in vitro und in vivo immunologische Reaktionen. Der signifikante immunsuppressive Effekt von CTLA4-IG konnte in verschiedenen tierexperimentellen Untersuchungen zur Entwicklung von Toleranz nach Organtransplantation aufgezeigt werden. Allerdings waren die Ergebnisse nach CTLA-4Ig Therapie in den nachfolgenden Untersuchungen variable und ein Großteil der transplantierten Organe wurde letztendlich abgestoßen. Neuere Studien zeigen das die Effizienz der CTLA-4Ig Therapie von dem Zeitpunkt der Gabe abhängen. Weiterhin gibt es Anhalte dafür, daß dieser Effekt durch spenderabgeleitete Transfusionen noch verstärkt werden kann. Für uns stellte sich daher die Frage ob durch die Kombination von CTLA-4IG und Applikation spenderabgeleiteter Splenozyten ein additiver immunsuppressiver Effekt zu erreichen ist und untersuchten dies im Modell der Rattenlebertransplantation (ORLT). Methodik: Wir führten Rattenlebertransplantationen (ORLT) im arterialisierten, voll allogenen Modell Da (RT1a) auf Lew (RT1l) in Standardtechnik durch. Die Ratten erhielten in verschiedenen Gruppen vor/nach der Transplantation CTLA-4Ig oder die Kombination von CTLA-4Ig mit spenderabgeleiteten oder unspezifischen Milzzellen. Ergebnisse: Bei der Vorbehandlung der Empfänger, entweder mit spenderabgeleiteten Zellen oder CTLA-4Ig, ließ sich eine Verbesserung des Transplantatüberlebens, aber keine Langzeitakzeptanz des Transplantates erreichen. Erst die Kombinationstherapie vor der Transplantation gewährleistete ein langfristiges Organüberleben ohne Zeichen für chronische Rejektionen nach mehr als 150 Tagen. Die Therapie mit spenderabgeleiteten Zellen am Tag der Transplantation oder verzögert nach 4 Tagen nach Transplantation veränderte die Überlebenszahlen nicht. Die verzögerte postoperative Therapie mit CTLA-4Ig, wie sie auch von anderen Gruppen durchgeführt wurde, resultierte in unseren Versuchen in einem verlängertem Überleben, führte aber nur bei 2/7 Tieren zur langfristigen Transplantatakzeptanz. Die zusätzliche Applikation nicht abgeleiteter Milzzellen verbesserte die Ergebnisse nicht signifikant. Transplantatakzeptanz bei allen Tieren ließ sich wiederum nur durch die Kombination spenderabgeleiteter Zellen und CTLA-4Ig erreichen. Spenderabgeleiteter Mikrochimärismus trat bei allen Tieren, also auch bei Kontrolltieren trotz ablaufender Abstoßung am 6. POD nach ORLT auf. Am 12. POD zeigten tolerante Gruppen noch spenderabgeleitete Zellen, wohingegen diese bei abstoßenden Gruppen nicht mehr nachweisbar waren. Im Langzeitverlauf waren diese spenderabgeleiteten Zellen auch in toleranten Tieren nur noch vereinzelt nachzuweisen. Eine Verschiebung der Zytokinantwort von TH1- Richtung TH2-Zytokinen konnte bei langfristig überlebenden Tieren nicht aufgezeigt werden. Im Gegenteil, die TH1-Antwort mit INF-g und IL-12b war bei toleranten, kombiniert mit CTLA-4Ig und adoptivem Zelltransfer behandelten Ratten früher und stärker ausgeprägt, aber schneller wieder rückläufig als bei unbehandelten Kontrollen. Dies galt nicht für IL-2, das in allen Gruppen, die mit CTLA-4Ig behandelt wurden, stark unterdrückt war. Langfristig überlebende Tiere zeigten mehr als 150 Tage nach ORLT nahezu keine Expression dieser TH1-Zytokine mehr, wohingegen IL-4 deutlich exprimiert wurde. Dies spricht gegen eine ausschließliche Verschiebung der Zytokinantwort nach TH2 und betont die Bedeutung von TH1-Zytokinen in der initialen Phase der Toleranzentwicklung. In toleranten Tieren mit adoptivem Zelltransfer zeigte sich im Vergleich zu abstoßenden Tieren eine stärkere Ausprägung von Apoptose in den Transplantaten, die zeitlich parallel zu der mRNA-Expression der TH1-Zytokine verlief. Dies läßt darauf schließen, daß Apoptose aktivierter T-Zellen der Mechanismus ist, der die additiven Effekte der CTLA-4Ig-Behandlung und des adoptiven Zelltransfers vermittelt. Die CTLA4-Ig Behandlung verhindert effektiv Abstoßungsepisoden nach ORLT. Die Effizienz der Behandlung kann durch die Applikation von spenderabgeleiteten Zellen noch signifikant verbessert werden. Hierbei spielt die Herunterregulation von IL-2 und Hochregulierung von INF-g eine maßgebliche Rolle, wohingegen der spenderabgeleitete Chimärismus von nachgeordneter Rolle zu sein scheint. Parallel zu dem Nachweis von IFN-g finden sich mehr apoptotische Zellen am Tag 6 in den Transplantaten der später toleranten Ratten, verglichen mit den abstoßenden Kontrolltieren. Dies weist in diesem Modell, im Gegensatz zu anderen Theorien, auf einen immunaktivierten Mechanismus mit nachfolgender Apoptose aktivierter Lymphozyten hin / Blockage of co-stimulatory CD28-mediated signals by CTLA4-Ig inhibits in vitro and in vivo immune responses. However, in recent trials monotherapy with CTLA4-Ig failed to introduce long-term survival in several animal transplant models. The study was conducted to investigate the effectiveness of CTLA-4Ig treatment with additional application of donor splenocytes in preventing rejection and improving graft function in rat liver allografts. DA rats (RT1a) were used as donors and Lew (RT1l) rats as recipients in an orthotopic liver transplantation model (ORLT). Recipients were divided in 3 groups depending on the start of treatment: The first group was treated prior to transplantation with CTLA-4Ig (0.5 mg i.p.) alone or in combination with donor derived or donor unspecific 2.5 x 108 splenocytes. The second group was treated simultaneously at transplantation with CTLA-4Ig or received no further treatment and served as controls. The third group received an ORLT and was treated postoperatively on day 3 and 4 with CTLA4-Ig alone or in combination with donor derived or unspecific spleen cells. Only the combination of CTLA-4Ig and donor derived cells pre- or postoperatively led to a 100% graft survival in the long-term. The treatment with CTLA-4Ig alone at each time point led to prolonged graft survival but not to a long-term graft survival. The additional administration of donor unspecific cells could improve these results, however, the differences were not significantly different between these groups. All rats without any treatment died within 12 days after ORLT. When treating the rats with donor derived spleen cells prior to transplantation the survival was significantly prolonged. The application of donor unspecific cells alone pre- and postoperatively had no effect on the survival rates. Microscopic and macroscopic studies of the liver demonstrated no signs of ongoing rejection after 150 days in rats treated with the combination of CTLA4-Ig and donor derived cells. All other long term survivors demonstrated signs of chronic rejection with bile duct loss. Immunohistological staining for DA specific surface antigen demonstrated donor specific chimerism with no predominance in any group. In the early postoperative course, the expression of IL-2 in liver specimen was significantly reduced in all groups receiving CTLA-4Ig. In contrast to this the tolerant rats surviving long-term showed a marked expression of IFN-g in the early course after ORLT. Additionally, these rats showed on day 6 after ORLT more apoptosis in the liver graft specimens compared to rejecting controls. CTLA4-Ig treatment is highly effective in rat liver transplantation and ensure long term survival. Pretransplant or delayed treatment with CTLA4-Ig alone prolongs survival but does not introduce long term tolerance. The effectiveness of the treatment can be markedly improved by the additional application of donor derived cells. The downregulation of IL-2 is mainly involved in the development of tolerance whereas detection of donor specific chimerism is not correlated to the development of tolerance in our study. Additionally an activation induced cell death via IFN-g may be involved in the tolerance induction. Although the mechanisms are still not completely understood immunomodulation by adaptive cell transfer and costimulatory blockage is an interesting and promising option for the future of clinical liver transplantation.

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Einleitung Der Einsatz von Stammzellen als Grundlage neuer therapeutischer Strategien wird bereits seit über 25 Jahren intensiv erforscht. Stammzellen sind in der Lage, in verschiedene funktionale Zelltypen auszudifferenzieren und verfügen über ein enormes Proliferationspotential (NAM et al. 2015). Ausgehend von den Fähigkeiten von Stammzellen sehen Forscher und Kliniker erstmals eine realistische Möglichkeit, kurative Therapieoptionen für Erkrankungen zu entwickeln, die bisher als schwer behandelbar oder sogar unheilbar angesehen wurden. Davon könnten insbesondere Patienten chronisch-degenerativer neurologischer und zerebrovaskulärer Erkrankungen, einschließlich der großen Anzahl an Schlaganfallopfern, profitieren. Schlaganfälle repräsentieren eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt (LOPEZ et al. 2006). Ein Drittel der betroffenen Patienten verstirbt innerhalb eines Jahres, während etwa 40% von dauerhaften Behinderungen betroffen sind (MOZAFFARIAN et al. 2015). Trotz intensiver Forschung existieren neben der systemischen Thrombolyse, die auf einen engen Zeitraum von maximal 4,5 Stunden nach dem Akutereignis beschränkt ist, keine zugelassenen Therapieoptionen (HACKE et al. 2008, SAVER et al. 2009). Zelltherapeutische Strategien zur Behandlung des Schlaganfalls werden daher als besonders vielversprechend angesehen (ANDRES et al. 2011). Neben den bereits gesicherten Erkenntnissen zur stammzelltherapeutischen Sicherheit und Wirksamkeit aus Studien unter Einsatz gängiger Nagermodellen (BLISS et al. 2006, JOO et al. 2013) wird insbesondere die Überprüfung der Wirksamkeit an geeigneten Großtiermodellen gefordert, die die Situation des menschlichen Schlaganfallpatienten möglichst realistisch wiedergeben sollen (SAVITZ et al. 2011). Eine Voraussetzung für die erfolgreiche Testung eines zelltherapeutischen Ansatzes in einem Großtiermodell mit fokaler zerebraler Ischämie besteht darin, ein langfristiges Überleben xenogener Zelltransplantate durch ein geeignetes Immunsuppressionsprotokoll zu erreichen. Die Notwendigkeit einer Immunsuppression besteht darin, dass sowohl allo- als auch xenogene Transplantate eine Immunantwort beim Empfänger auslösen und somit zu einer Abstoßungsreaktion führen können (JANEWAY 2002). Die Anwendung von immunsuppressiven Medikamenten geht dabei aber häufig mit Nebenwirkungen einher. Insbesondere beim Schaf existiert jedoch nur eine limitierte Datenlage zu immunsuppressiven Protokollen und deren Nebenwirkungen. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine xenogene Transplantation von fetalen humanen neuralen Progenitorzellen (fhNPZ) in einem gesunden Schafsmodell durchzuführen, um die Wirksamkeit in Hinblick auf das Transplantatüberleben und die Nebenwirkungen einer Immunsuppression mittels Cyclosporin A (CsA) zu untersuchen. Materialien und Methoden Hierfür wurden je 5 Schafe in zwei Gruppen über einen Zeitraum von 64 Tagen immunsupprimiert (iCsA: 3 mg CsA/kg 2x tägl. bis einschließlich Tag 36, danach 3 mg CsA/kg 1x tägl. jeden 3. Tag; kCsA: kontinuierlich 3 mg CsA/kg 2x tägl.), während eine Kontrollgruppe (Kon) von ebenfalls 5 Tieren keine Immunsuppression erhielt. Am Versuchstag 22 wurde den Schafen eisenmarkierte fhNPZ (Eisenkonzentration: 3,0 mM, ca. 200.000 Zellen pro Transplantationsposition) stereotaktisch in das gesunde Gehirn transplantiert. Aufgrund der Eisenmarkierung der Stammzellen konnten diese an den Versuchstagen 23, 36 und 64 mittels 3,0 MRT-Aufnahmen in vivo überwacht und anschließend ex vivo das Überleben der fhNPZ im Schafhirn 42 Tage nach Transplantation histologisch untersucht werden. Für die Untersuchungen zu Wirkspiegeln und Nebenwirkungen von CsA im Schaf wurden den Versuchstieren innerhalb des Versuchszeitraums regelmäßig Blutproben entnommen und am Versuchsende eine pathologische und histologische Untersuchung von Leber und Nieren durchgeführt. Ergebnisse Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die CsA-Wirkspiegel im Blut bei der kCsA (424,0 ± 135,0 ng/ml) signifikant höher waren im Vergleich zur iCsA (198,5 ± 155,9 ng/ml). Diese Unterschiede besaßen jedoch keinen Einfluss auf das Langzeitüberleben der transplantierten fhNPZ. In keiner der drei Versuchsgruppen konnten vitale Zellen 42 Tage nach der Transplantation aufgefunden werden. Die Untersuchung der Nebenwirkungen von CsA ergab, dass die Langzeitgabe von CsA Anzeichen für einen hämatologischen Einfluss zeigt. Ebenso konnte sowohl eine hepatotoxische, als auch eine nephrotoxische Wirkung von CsA beim Schaf nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass die Gabe von 3 mg CsA/kg 2x tägl. nicht suffizient einer Abstoßungsreaktion xenogener ins Schafhirn transplantierter fhNPZ entgegenwirkt. Für das Ziel einer suffizienten zelltherapeutischen Anwendung im Schaf nach einem Schlaganfall sind somit weitere Untersuchungen zu einer wirksamen Immunsuppression beim Schaf und zu einem verbesserten Transplantatüberleben notwendig. Desweiteren konnten klinische und pathologische Nebenwirkungen beim Schaf durch die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA festgestellt werden.:INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... VI 1 EINLEITUNG .............................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT ......................................................................................................... 2 2.1 Klassifikation von Stammzellen ......................................................................................... 2 2.2 Tierexperimentelle Stammzelltherapie beim Schlaganfall .............................................. 5 2.2.1 Hintergrund der translationalen Forschung am Tiermodell ............................................... 5 2.2.2 Tiermodelle der fokalen zerebralen Ischämie .................................................................... 6 2.2.3 Das Schaf als Großtiermodell ............................................................................................ 7 2.2.4 Transplantation fhNPZ als zelltherapeutischer Ansatz nach fokaler zerebraler Ischämie . 8 2.2.4.1 Die In-vivo-Überwachung von in Schafhirne transplantierten fhNPZ .......................... 9 2.2.4.2 Der immunhistochemische Nachweis vitaler humaner Zellen ex vivo im Schafhirn .. 11 2.3 Immunsuppression nach der Transplantation von Stammzellen .................................. 12 2.3.1 Wirkmechanismen des angeborenen und erworbenen Immunsystems ........................... 12 2.3.2 Immunantwort nach Transplantation ............................................................................... 12 2.3.3 Wirkstoffklassen von Immunsuppressiva ........................................................................ 14 2.3.4 Cyclosporin A .................................................................................................................. 16 2.3.4.1 Wirkmechanismus von Cyclosporin A ........................................................................ 16 2.3.4.2 Pharmakokinetik und Metabolisierung von Cyclosporin A ........................................ 16 2.3.4.3 Applikation und Dosierung von Cyclosporin A .......................................................... 17 2.3.4.4 Nebenwirkungen und Toxizität von Cyclosporin A .................................................... 17 2.3.4.5 Anwendung von Cyclosporin A in der tierexperimentellen Forschung ...................... 18 2.4 Fragestellung und Versuchsziele der Dissertation .......................................................... 19 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 20 3.1 Zellkultur ............................................................................................................................ 20 3.1.1 Zellkulturmedien und Zusammensetzung ........................................................................ 20 3.1.2 Auftauen und Aussaat der Zellen .................................................................................... 20 3.1.3 Ablösen der Zellen ........................................................................................................... 21 3.1.4 Zellzählung mittels Trypanblautest ................................................................................. 21 3.1.5 Passagieren der Zellen ..................................................................................................... 21 3.1.6 Eisenmarkierung der Zellen ............................................................................................. 22 3.1.7 Proliferations- und Vitalitätstests .................................................................................... 22 3.1.8 Ablösen der Zellen für Transplantationsexperimente ...................................................... 22 3.1.9 Mykoplasmentest ............................................................................................................. 23 3.2 Bestimmung der T2 NMR-Relaxationszeit ...................................................................... 23 3.3 Gelphantome ....................................................................................................................... 24 3.3.1 Herstellung und Ausgießen .............................................................................................. 24 3.3.2 Anfertigen von In-vitro-MRT-Aufnahmen zum Nachweis der eisenmarkierten fhNPZ . 25 3.4 Versuchstiere ...................................................................................................................... 26 3.4.1 Tierhaltung ....................................................................................................................... 26 3.4.2 Versuchstiere im tierexperimentellen Versuch ................................................................ 26 3.4.2.1 Tierärztliche Untersuchung der Vitalparameter .......................................................... 26 3.4.2.2 Durchführung des neurologischen Untersuchungsgangs ............................................. 27 3.4.2.3 Blutprobenentnahme, Versand und Detektiermethode ................................................ 27 3.5 Versuchsaufbau und Durchführung ................................................................................ 28 3.5.1 Anästhesie ........................................................................................................................ 29 3.5.2 Schmerzmittelregime und Infektionsprophylaxe ............................................................. 30 3.5.3 Implantation des Portsystems .......................................................................................... 31 3.5.4 Applikation von CsA ....................................................................................................... 32 3.5.4.1 Herstellung der Infusionslösung .................................................................................. 32 3.5.4.2 Applikation über das Portsystem ................................................................................. 33 3.5.5 Stammzelltransplantation ................................................................................................. 33 3.5.5.1 Anfertigen von MRT-Aufnahmen im 1,5 T MRT ....................................................... 34 3.5.5.2 Planung der stereotaktischen Zelltransplantation ........................................................ 34 3.5.5.3 Stereotaktische Zelltransplantation .............................................................................. 34 3.5.6 Nachweis der eisenmarkierten Stammzellen im 3,0 T MRT ........................................... 35 3.5.6.1 Methodik zum Nachweis und zur Quantifizierung der eisenmarkierten fhNPZ im Schafhirn ...................................................................................................................... 35 3.5.7 Sektion der Versuchstiere und Probenentnahme ............................................................. 36 3.5.8 Anfertigen der histologischen Gewebeschnitte ................................................................ 36 3.5.8.1 Herstellung der Paraffinschnitte .................................................................................. 37 3.5.8.2 Probenaufarbeitung und Lamellieren der Gehirne ....................................................... 37 3.5.8.3 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................................... 38 3.5.9 Histologische Färbungen ................................................................................................. 38 3.5.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ....................................................................................... 40 3.5.9.2 Berliner Blau-Färbung ................................................................................................. 40 3.5.9.3 Fouchét-Färbung .......................................................................................................... 40 3.5.9.4 Immunmarkierung mit STEM101-DAB und Berliner Blau-Färbung ......................... 40 3.5.9.5 Immunhistologische Markierung mit Iba1-Antikörpern .............................................. 40 3.5.10 Auswertung der histologischen Präparate ........................................................................ 41 3.6 Statistik ............................................................................................................................... 44 4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................. 47 4.1 Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen .................................. 47 4.1.1 Welche Eisenkonzentration ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten? ........... 47 4.1.2 Können markierte fhNPZ durch eine T2-gewichtete MRT-Sequenz dargestellt werden? ......................................................................................................................................... 49 4.1.3 Wo liegt das Detektionslimit markierter fhNPZ in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz? ......................................................................................................................................... 50 4.2 Der Einfluss des Immunsuppressivums CsA auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im Schafhirn .......................................................................................................... 51 4.2.1 Gibt es gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen? ................. 51 4.2.2 Besitzt die Transplantation fhNPZ einen neurologischen Einfluss auf die Sensorik und Motorik? .......................................................................................................................... 54 4.2.3 Was geschieht mit den transplantierten fhNPZ im Zeitverlauf und Gruppenvergleich? . 55 4.2.4 Können vitale fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden? ......................................................................................................................................... 56 4.3 Klinische und pathologische Nebenwirkungen von CsA im Schaf ................................ 59 4.3.1 Beeinflusst die CsA-Applikation in vivo klinische Parameter oder Blutwerte beim Schaf? ......................................................................................................................................... 59 4.3.1.1 Auswertung der Körpertemperaturverläufe ................................................................. 59 4.3.1.2 Auswertung der Körpergewichtsverläufe .................................................................... 60 4.3.1.3 Auswertung hämodynamischer Parameter .................................................................. 61 4.3.1.4 Auswertung hämatologischer Blutparameter .............................................................. 62 4.3.1.5 Auswertung leberspezifischer Blutparameter .............................................................. 65 4.3.1.6 Auswertung nierenspezifischer Blutparameter ............................................................ 69 4.3.1.7 Auswertung sonstiger Blutparameter .......................................................................... 70 4.3.2 Können ex vivo toxische Einflüsse von CsA auf das Schaf nachgewiesen werden? ....... 71 4.3.2.1 Makroskopische Auswertung der Sektionsbefunde .................................................... 71 4.3.2.2 Histologische Auswertung Leber und Nieren ............................................................. 73 5 DISKUSSION ............................................................................................................................. 76 5.1 Hintergrund der Arbeit und Versuchsziele ..................................................................... 76 5.2 Bewertung des Studiendesigns und der Versuchsdurchführung .................................. 76 5.2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ........................................................................ 76 5.2.2 Studiendesign und das Schaf als Tiermodell ................................................................... 77 5.3 Diskussion der Ergebnisse ................................................................................................. 78 5.3.1 Ein Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen ist möglich .......... 78 5.3.1.1 Eine Eisenkonzentration von 3,0 mM ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten ................................................................................................................. 79 5.3.1.2 Markierte fhNPZ können durch eine T2-gewichtete Sequenz dargestellt werden ...... 80 5.3.1.3 Das Detektionslimit markierter fhNPZ liegt in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz bei 50.000 Zellen ......................................................................................................... 81 5.3.2 Die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA besitzt keinen Einfluss auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im immunprivilegierten Gehirn .......................... 81 5.3.2.1 Es gibt gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen ............... 81 5.3.2.2 Die Transplantation von fhNPZ besitzt keinen bedeutenden Einfluss auf die Sensorik und Motorik ................................................................................................................. 83 5.3.2.3 Die transplantierten fhNPZ zeigen Veränderungen in Zeitverlauf und Gruppenvergleich ........................................................................................................ 84 5.3.2.4 Es können keine vitalen fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden .................................................................................................. 85 5.3.2.5 Schlussfolgerung zur Immunsuppression mittels CsA nach Stammzelltransplantation ins Schafhirn ................................................................................................................ 87 5.3.3 Die Langzeitgabe von CsA verursacht Anzeichen für pathologische Veränderungen und klinische Symptome beim Schaf ...................................................................................... 88 5.3.3.1 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst klinische Parameter beim Schaf .................... 88 5.3.3.2 Die Langzeitgabe von CsA zeigt wahrscheinlich keine hämodynamische Wirkung .. 89 5.3.3.3 Die Gabe von CsA zeigt Anzeichen für eine hämatologische Wirkung beim Schaf ... 89 5.3.3.4 Die Gabe von CsA zeigt eine hepatotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 90 5.3.3.5 Die Gabe von CsA zeigt eine nephrotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 93 5.3.3.6 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst weitere unspezifische Blutparameter ............ 95 5.3.3.7 Schlussfolgerungen zu Nebenwirkungen von CsA beim Schaf .................................. 95 5.4 Allgemeine Schlussfolgerung ............................................................................................. 95 5.5 Ausblick ............................................................................................................................... 96 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 97 7 SUMMARY ................................................................................................................................. 99 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................. 101 9 ANHANG ................................................................................................................................... 110 9.1 Ergänzende Tabelle zur Herstellung der Gelphantome ............................................... 110 9.2 Ergänzende Tabellen zur Herstellung histologischer Präparate ................................. 111 9.2.1 Herstellung der Paraffinblöcke ...................................................................................... 111 9.2.2 Histologische Färbungen und Immunhistochemische Methoden .................................. 112 9.3 Ergänzende Tabellen zur Statistik ................................................................................. 116 9.4 Verwendete Referenzwerte ............................................................................................. 118 9.5 Übersicht der ausgewerteten Blutparameter ................................................................ 119 9.6 Übersicht zu tierexperimentellen Einsätzen von Stammzellen in Schlaganfallmodellen ........................................................................................................................................... 122 9.7 Auflistung verwendeter Materialien und Geräte .......................................................... 123 9.8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 129 9.9 Formelverzeichnis ............................................................................................................ 130 9.10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 130 10 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 132

Die entzündliche Kardiomyopathie ist eine heterogene Erkrankung. Die häufigste Ursache ist eine Virusinfektion, wobei Parvovirus B19 (B19V) der bedeutendste Erreger ist. In dieser Arbeit wurden potenzielle Therapie für die speziellen klinischen Verläufe und deren Phänotypen untersucht. In vitro konnte gezeigt werden, dass Telbivudin in B19V-infizierten/B19V-non-structural protein-1-stimulierten humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HMEC-1) endothelial-protektiv wirkt. In einem klinischen Versuch wurden dann 4 Patienten, bei denen eine aktive Transkription des B19V nachgewiesen wurde, für 6 Monate mit Telbivudin behandelt. Alle Patienten verbesserten sich. Ein anderes klinisches Szenario stellt die schwere Entzündung des Myokards dar, welche gewöhnlich mit einer inaktiven/persistierenden Infektion des B19V verbunden ist. Eine Behandlung mit Immunsuppressiva ist hier umstritten, da eine Reaktivierung des Virus befürchtet wird. Um diesen Aspekt weiter zu untersuchen, würde eine Therapie mit Prednisolon in Kombination mit Azathioprin bei 51 B19V-positiven und 17 B19V-negativen Patienten angewandt. Beide Gruppen profitierten in ähnlichem Maße von der Kombinationstherapie, wobei sich die Virusmenge nicht signifikant veränderte. Bei B19V-negativen Patienten konnte über die Persistenz von CD20+ B-Lymphozyten in den EMBs die Untergruppe der „Steroide non-responder“ klassifiziert werden. Im weiteren Verlauf wurden 6 Patienten mit Rituximab, einem monoklonalen Antikörper, der spezifisch gegen CD20+ B-Lymphozyten gerichtet ist, behandelt. Hiervon zeigten 5 Patienten eine ausgezeichnete klinische Verbesserung. Ein Patient mit Myokarditis-induzierten kardiogenen Schock zeigt, dass die Entlastung des linken Ventrikels mittels eines Mikroaxialpumpensystems zu einer rapiden Abnahme der Entzündungszellen führt. Zusammenfassend liefert diese Arbeit Belege für die Wirksamkeit und die Notwendigkeit einer phänotypbasierten Behandlung bei der entzündlichen Kardiomyopathie. / Inflammatory cardiomyopathy is a heterogenous disease. Viral etiologies are the most common, with parvovirus B19 (B19V) being the most prominent culprit. Currently, no specific treatment for inflammatory cardiomyopathy exists. In this study, tailored treatment strategies were investigated as potential therapies for specific clinical scenarios. The antiviral drug telbivudine was investigated in the setting of EMB-proven B19V-associated inflammatory cardiomyopathy. In cell culture, telbivudine exhibited endothelial-protective effects on B19V-infected/B19V-non-structural protein-1-stimulated human microvascular endothelial cells (HMEC-1). Clinically, four B19V-positive patients improved following six-month telbivudine regimen in a single-patient use approach. The results were translated to the “PreTOPIC” clinical study, for further evaluation in a randomized placebo-controlled setting. In a different clinical scenario, severe myocardial inflammation is usually associated with inactive/persistent B19V. Here, the use of immunosuppression is controversial, fearing viral flare-up. We investigated combined prednisolone/azathioprine therapy in 51 B19V-positive and 17 B19V negative patients in a single-center observational study. Both groups gained similar benefit, while viral loads did not significantly vary. Among virus-negative phenotypes, EMB-proven CD20+ B lymphocyte persistence characterized a subgroup of steroid non-responders. In this cohort, six patients were treated with rituximab, a monoclonal antibody selectively targeting CD20+ B lymphocytes. Five patients showed outstanding clinical improvement parallel to CD20+ B lymphocyte depletion. Lastly, in a single case of myocarditis-induced cardiogenic shock, mechanical left ventricular unloading via axial flow pump proved to exert disease-modifying effects. In conclusion, this thesis provides evidence for the efficacy and need for phenotype-based inflammatory cardiomyopathy treatment.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

Die vorliegende Arbeit beinhaltet umfangreiche histologische Untersuchungen an verschiedenen Tumoren bezüglich ihrer Infiltration durch Makrophagen-Subpopulationen, Granulozyten und Lymphozyten. Hierfür wurden 18 Gewebe-Mikroarrays mit jeweils 200 - 300 Tumorstanzen aus insgesamt 27 Organen des Gastrointestinaltraktes, des Urogenitaltraktes, des Respirationssystems und des endokrinen Systems angefertigt. Da alle Proben mit derselben Technik (Gewebe-Mikroarrays, Immunhiostochemie) ausgewertet wurden, bestand nun erstmalig die Möglichkeit eines direkten Vergleiches zwischen den verschiedenen Tumoren unterschiedlicher Organe. Für die immunhistochemischen Untersuchungen wurden fünf verschiedene Antikörper (anti-KP1, anti-PG-M1, anti-MRP8, anti-MRP14, anti-MRP8/14) eingesetzt. Die Antikörper gegen die Epitope PG-M1 und KP1 gelten als Pan-Makrophagen-Marker. Die Antikörper anti-MRP8, anti-MRP14 und anti-MRP8/14 gelten als Marker für entzündlich aktivierte Makrophagen. Diese Makrophagen wurden in einen aktiven inflammatorischen Typ (MRP14+, MRP8/14+), der proinflammatorische Zytokine wie TNF-a und Sauerstoffradikale bildet, und in einen chronisch inflammatorischen Typ (MRP8+) eingeteilt. Die Formation des MRP8/14-Heterodimers korreliert mit der zellulären Aktivierung wie z. B. mit der Aktivierung der NADPH-Oxidase. Es wurde beschrieben, dass diese Makrophagen auf Grund ihrer Eigenschaften eventuell die Tumorzellproliferation inhibieren und zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen ausüben können. Für die verschiedenen Tumorgewebe wurden höhere Makrophagendichten im Vergleich zum Normalgewebe und eine vergleichsweise geringe Dichte an MRP+ Makrophagen sowie signifikante Korrelationen zwischen den verschiedenen Makrophagen-Subpopulationen festgestellt. Die Dichte der Lymphozyten korrelierte negativ mit steigendem Tumorzellanteil und mit fortgeschrittenem Tumorstadium. Die Abnahme der Lymphozyten (Gastrointestinal- und Respirationstrakt) im Tumorgewebe im Vergleich zum tumorfreien Gewebe sowie die geringe Anzahl der potenziell tumoriziden MRP8/14+ Makrophagen lässt vermuten, dass die Immunantwort gegen den Tumor unterdrückt wird. Die positive Assoziation zwischen Makrophagen und Lymphozyten weist jedoch darauf hin, dass Makrophagen nicht am Rückgang der Lymphozyten beteiligt sind . Eine Korrelation der Makrophagen mit klinisch relevanten Parametern (pT-Stadium, UICC-Stadium, Lymphknotenmetastasen) zeigten ein voneinander abweichendes Infiltrationsmuster der CD68+ und MRP+ Makrophagen, was auf unterschiedliche Funktionen hinweist. Ferner liegen zahlreichen funktionelle Untersuchungsergebnisse anderer Arbeitsgruppen vor, welche darauf hinweisen, dass Makrophagen durch Hypoxie angezogen werden und im hypoxischen Tumorgewebe schließlich an der Neubildung von Blut- und Lymphgefäßen beteiligt sind. Um einen möglichen Zusammenhang zu zeigen, wurde mit den Antikörpern anti-CD31 und anti-CD34 die Gefäßdichte in Tumoren untersucht. Es zeigten sich zahlreiche positive Korrelationen zwischen Gefäßen und Makrophagen, jedoch konnte in den tumorfreien Geweben kein Zusammenhang zwischen beiden Größen gefunden werden. Das Vorkommen größerer Makrophagendichten in Tumoren mit wenig Nekrose als in Tumoren ohne Nekrose, die positive Korrelation zwischen der Anzahl der Gefäße und der Zahl der Makrophagen in Tumoren und die Unabhängigkeit von Makrophagen und Gefäßen im tumorfreien Gewebe legt die Vermutung nahe, dass TAM die Angiogenese begünstigen. Trotz vieler ähnlicher Charakteristika zwischen den Tumoren unterschiedlichen Ursprungsgewebes wurden auch Unterschiede festgestellt, die besonders die Anzahl der Makrophagen-Subpopulationen betreffen. Weitere Studien zur Aufklärung der Funktion unterschiedlicher Makrophagen-Subpopulationen (z. B. Immunsuppression, Neoangiogenese) sind notwendig, um deren Relevanz für das Tumorwachstum und die Tumorprogression aufzuklären.

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