Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-04-08T17:06:36Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AspectosImunopatológicosInfecção.pdf: 3148066 bytes, checksum: b78dd8d04093c5ce1f075d22908e999c (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-04-09T10:57:07Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AspectosImunopatológicosInfecção.pdf: 3148066 bytes, checksum: b78dd8d04093c5ce1f075d22908e999c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-09T10:57:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_AspectosImunopatológicosInfecção.pdf: 3148066 bytes, checksum: b78dd8d04093c5ce1f075d22908e999c (MD5) Previous issue date: 2013 / Mesmo apresentando um repertório de moléculas de superfície distinto, ambas as formas infectantes do Trypanosoma cruzi, tripomastigotas metacíclicas - TM - (transmissão vetorial) e sanguíneas - TS - (transmissão não vetorial), são funcionais na interação parasito-hospedeiro e/ou invasão de células-alvo. Entretanto, a interação inicial com o hospedeiro vertebrado pode desencadear uma resposta imune diferenciada possivelmente relacionada à evolução clínica distinta da doença de Chagas (DC) ao longo da fase crônica. Estudos do nosso grupo de pesquisa demonstraram que na fase aguda da DC a interação inicial entre formas TS e o hospedeiro vertebrado induz um perfil de resposta imunológica diferente daquele observado na infecção por formas TM. A infecção por TS é mais exuberante e, mesmo com o controle da parasitemia, não há o estabelecimento de uma resposta imunoreguladora eficaz, levando assim a uma inflamação persistente. A infecção por TM é mais silenciosa, promovendo uma resposta imune capaz não só de controlar o número de parasitos durante a fase inicial da infecção como também de estabelecer uma resposta imunoreguladora ao final da fase aguda. Dessa maneira, o estudo da infecção por diferentes formas infectantes do T. cruzi na fase crônica da infecção possibilitará uma melhor compreensão do efeito da fonte do inóculo sobre a interação T. cruzi x células do hospedeiro. Além disso, como as transmissões por via transfusional e congênita em países não endêmicos têm sido reconhecidas como um sério problema será importante saber o impacto da infecção por TS no curso da DC. Baseado nisso, o objetivo desse trabalho foi avaliar as alterações relacionadas aos parâmetros imunológicos celulares na fase crônica da infecção experimental de camundongos por formas TS ou TM da cepa Berenice-78 do T. cruzi. Os resultados mostraram no sangue periférico redução de leucócitos totais e linfócitos em ambos os grupos infectados e de monócitos apenas no grupo TS. Os animais infectados por formas TM apresentaram aumento de células NK e TCD4+ circulantes. A avaliação da produção de citocinas intracitoplasmáticas por esplenócitos demonstrou aumento do percentual de células TCD4+ produtoras de TNF- no grupo TS e de IL-10+ no grupo TMPor outro lado houve redução do percentual de células TCD8+ IFN-no grupo TM. Também foi verificado aumento significativo no percentual das citocinas TNF-, IFN- e IL-10 produzidas por linfócitos B no grupo TM. A avaliação da expressão de citocinas no coração mostrou redução da expressão do mRNA da citocina TNF-no grupo TM e aumento das citocinas IL-10 e TGF-no grupo TS. Qualitativamente foram observadas células inflamatórias no coração dos animais dos dois grupos, TS e TM. Porém, quantitativamente não houve diferença significativa entre eles, mesmo que no grupo TS seja observado um maior número de células inflamatórias. Por outro lado, observou-se aumento significativo da área de fibrose nos grupos TS e TM em relação ao controle e maior área de fibrose no TM quando comparado ao TS. Diante destes resultados, sugere-se que a infecção por TM já se resolveu aos 180 dias, com um perfil de citocinas anti-inflamatório e evolução para um quadro de resolução por fibrose mais expressivo. No grupo TS há um perfil de citocinas ainda pró-inflamatório, com um quadro de fibrose cardíaca em ascensão, como indicado pela presença de TGF-, sugerindo que provavelmente a infecção por TS evolui para um quadro resolutivo mais tardio e grave. ___________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Despite presenting a distinct repertoire of surface molecules, both infective forms of Trypanosoma cruzi, metacyclic trypomastigotes - MT - (vectorial transmission) and blood trypomastigotes - BT - (no vectorial transmission), are functional in the host-parasite interaction and / or invasion of target cells. However, the initial interaction with the vertebrate host can trigger an immune response that is differentiated and possibly related to distinct clinical evolution of Chagas disease (CD) during the chronic phase. Studies of our research group showed that in the acute phase of CD the initial interaction between BT forms and vertebrate host induces an immune response profile different from that observed in infections with MT forms. The infection with BT forms is more striking and even with the control of parasitemia, there is no establishment of an effective immunoregulatory response, thus leading to persistent inflammation. MT infection is more silent, promoting an immune response capable of controlling not only the number of parasites during the initial phase of infection as well as to establish an immunoregulatory response in the end of acute phase. Therefore, the study of infection by different infective forms of T. cruzi in the chronic phase of infection will enable a better understanding of how the source of inoculum may interfere with the T. cruzi/host cells interaction. Moreover, due to the fact that the transfusion and congenital transmissions in non-endemic countries are recognized as a serious problem would be important to know what is the impact of infection with BT forms in the disease course. Based on this, the aim of this study was to evaluate changes related to cellular immunological parameters in chronic experimental infection of mice by BT and MT forms of Berenice-78 T. cruzi strain. The results showed that in peripheral blood, the infection caused a reduction in total leukocytes and lymphocytes in both infected groups and a decrease in the number of monocytes in the BT group. The animals infected with MT forms showed increased of NK and CD4+circulating cells. The evaluation of intracytoplasmatic cytokine production by splenocytes showed a significant increase in the percentage of TNF-, IFN-and IL-10 produced by B lymphocytes in MT group. It was observed an increase in the percentage of CD4+ cells producing TNF-a in the BT group and of CD4+IL-10+ cells in the MT group. On the other hand, there was a decrease in the percentage of CD8+IFN-+ cells in the MT group. The expression of cytokines in heart showed a reduction in mRNA expression of TNF-a in the MT group and an increase of IL-10 and TGF- in the BT group. The qualitatively analysis demonstrated the presence of inflammatory cells in the hearts of animals in both groups, BT and MT. However, quantitatively there was no significant difference between them, but in the BT group is observed a greater number of inflammatory cells. On the other hand, there was significant increase in the area of fibrosis in BT and MT groups compared to NI and increased fibrosis area in MT compared to BT. Given these results, it is suggested that the infection has resolved in MT at 180 days, with a profile of anti-inflammatory cytokines and evolution to a resolution profile followed by a fibrosis more expressive. In the BT group there is still a profile of proinflammatory cytokines, with a rising cardiac fibrosis, as indicated by the presence of TGF-, suggesting that probably infection by BT forms progresses to a later resolutive and severe process.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2014-11-10T17:02:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2014-11-18T14:41:41Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-18T14:41:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_InovaçõesDiagnósticoMonitoração.pdf: 2809852 bytes, checksum: 5e2dc6ce18b064089906e87dc171d3a6 (MD5) Previous issue date: 2013 / Um dos desafios em relação ao tratamento na fase crônica da doença de Chagas (DCh) são as limitações dos métodos disponíveis para detectar a cura parasitológica nessa fase da infecção. Sendo assim, esse trabalho visa estabelecer uma inovação metodológica na monitoração da cura parasitológica pós-tratamento etiológico da DCh, por meio da técnica de FC-ATE-Triplex, analisando IgG1 anti-T. cruzi. Como metodologia desse trabalho, foi proposto um modelo de pesquisa de anticorpos IgG1 anti-formas evolutivas vivas do T. cruzi (amastigota (AMA), tripomastigota (TRIPO) e epimastigota (EPI) fixada) por citometria de fluxo, empregando um modelo de segregação fluorescente diferencial (fluorescência 1- isotiacianto de fluoresceína) e um sistema de revelação fluorescente complementar (fluorescência 2- estreptoavidina-ficoeritrina). Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI em amostras de soros dos grupos tratado curado (TC) e tratado não curado (TNC), as amostras do grupo TC apresentaram uma baixa reatividade e as dos grupo TNC uma alta reatividade com as três formas evolutivas do T. cruzi. Após análise de desempenho dessa nova metodologia, os critérios de interpretação foram: diluição 1:000 e ponto de corte de 40% para AMA e diluição 1:250 e ponto de corte de 20% para TRIPO e EPI. Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI pela técnica proposta, em amostras de soros dos grupos não tratado (NT) e não infectado (NI), as amostras do grupo NT apresentaram valores de reatividade positivo e as do grupo NI valores de reatividade negativos com as três formas evolutivas. A reatividade de 28 amostras de soro do grupo tratado em avaliação (TEA) pela técnica de FC-ATE-Triplex revelou que 15 (53,6%) foram negativas com AMA, 11 (39,3%) com TRIPO e 8 (28,6%) com EPI. Avaliando a reatividade de IgG1 anti-AMA, TRIPO e EPI, em amostras de soros dos grupos TC e TNC em novas amostragens populacionais, todas as amostras do grupo TNC foram positivas com as três formas evolutivas, enquanto todas as amostras do grupo TC foram negativas com AMA, 5 das 7 amostras foram negativas com TRIPO e 6 das 7 foram negativas com EPI. Das 24 amostras do grupo TEA de uma nova amostragem populacional testadas pela FC-ATE-Triplex, 7 (29,2%) foram negativas com AMA, 1 foi negativa com TRIPO (4,2%) e 7 foram negativas com EPI (29,2%). A reatividade da FC-ATE-Triplex com o soro de pacientes com leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar americana (LTA) revelou que das 10 amostras de pacientes com LV, uma (10%) foi positiva com AMA, uma (10%) com TRIPO e duas (20%) com EPI, enquanto que dos 20 pacientes com LTA, 4 (20%) foram positivas com AMA, 6 (30%) com TRIPO e 10 (50%) com EPI. Sendo assim, a técnica de FC-ATE-Triplex apresentou um excelente desempenho na monitoração de cura parasitológica pós-tratamento etiológico, no diagnóstico e no controle de cura parasitológica precoce da doença de Chagas, mesmo quando testada em novas amostragens populacionais. Além do mais, essa nova metodologia, mesmo apresentando resultados falso-positivos, mostrou ser útil na segregação sorológica de pacientes chagásicos e de pacientes portadores de LV e de LTA. A reatividade diferencial observada em AMA, TRIPO e EPI sugere que na técnica de FC-ATE-Triplex existe a segregação de anticorpos pela afinidade pelo antígeno. As formas amastigotas do T. cruzi apresentaram uma maior reatividade, especificidade e mostraram ser boas fontes antigênicas na monitoração da cura parasitológica pós-tratamento etiológico e no controle de cura parasitológica precoce da doença de Chagas. _________________________________________________________________________ / ABSTRACT: One of the challenges regarding treatment in the chronic phase of Chagas disease (DCH) are the limitations of methods available to detect the parasitological cure at this stage of infection. In the present study, we have developed an innovative method to monitoring the parasitological cure after Chagas’ disease etiologic treatment. This method, named FC-ATE-Triplex, is based in simultaneous detection of IgG1 anti-T. cruzi by flow cytometry. It was proposed a model of antibody IgG1anti-live T. cruzi evolutive forms (live amastigotes (AMA) + live trypomastigotes (TRYPO) + fixed epimastigotes (EPI) fixed, using a model of differential segregation fluorescent (Fluorescence 1 - isotiacianto fluorescein) and a system of complementary fluorescence revelation (fluorescence 2 - streptavidin-phycoerythrin). The patients used in this study were divided in five groups: uninfected (NI), untreated (NT), treated cured (TC), treated not-cured (TNC) and treated under evaluation (TUE). The TC group samples showed a low reactivity and the TNC group a high reactivity with the three evolutive forms of T. cruzi. After performance analysis of this new approach, the interpretation criteria established were: 1:000 dilution and cutoff of 40% for AMA and 1:250 dilution and cutoff of 20% for EPI and TRYPO. The NT group samples showed values of positive reactivity and the NI group values of negative reactivity with the three evolutive forms of T. cruzi. The reactivity of 28 sera samples from the group TUE through the technique FC-ATE-Triplex revealed that 15 (53.6%) were negative with AMA, 11 (39.3%) with TRYPO and 8 (28.6%) with EPI. Assessing the reactivity of IgG1anti-AMA, TRYPO and EPI in sera samples of groups TC and TNC in new population samples, all samples of TNC group were positive with the three T. cruzi evolutive forms, while all samples of TC group were negative with AMA, 5 of 7 samples were negative with TRYPO and 6 of 7 were negative with EPI. Of the 24 samples of TUE group of a new population tested by FC-ATE-Triplex, 7 (29.2%) were negative with AMA, 1 was negative with TRYPO (4.2%) and 7 were negative with EPI (29.2%).). The reactivity of FC-ATETriplex with sera from patients with visceral leishmaniasis (VL) and American cutaneous leishmaniasis (ACL) revealed that of the 10 samples from patients with VL one (10%) was positive with AMA, one (10%) with TRYPO and two (20%) with EPI, while from 20 patients with ACL tested, 4 (20%) were positive with AMA, 6 (30%) with TRYPO and 10 (50%) with EPI. Thus, these results showed that FC-ATE-Triplex presented an excellent performance in monitoring of the parasitological cure after etiological treatment, in diagnosis and control of early parasitological cure of Chagas disease, even when tested on new sampling population. Moreover, this new methodology, even with false-positive results, proved to be useful in serological segregation of chagasic patients and patients with VL and ACL. The differential reactivity observed in AMA, TRYPO and EPI suggests that in the technique of FCATE-Triplex there is segregation of antibodies by antigenic affinity. The amastigotes of T. cruzi showed greater reactivity, specificity and to be good antigenic sources in monitoring parasitological cure after etiological treatment and control of early parasitological cure of Chagas disease.