Enterococcus spp. pertencem ao grupo das bactérias láticas e estão presentes em solos, águas, plantas, microbiota autóctone de vários alimentos e como membros da microbiota intestinal de humanos e animais. Esses microrganismos foram considerados por muito tempo como comensais, mas o aumento da severidade das infecções nosocomiais causadas por enterococos mutirresistentes a antimicrobianos e, a falta de conhecimento sobre seus fatores de virulência geram insegurança na utilização de cepas deste gênero na produção de alimentos como culturas fermentadoras e/ou probióticas. A diferença entre uma cepa de enterococos com potencial patogênico e outra aparentemente segura para uso em processamento de alimentos não é clara, e a probabilidade de que esta última adquira fatores de virulência merece investigação. O objetivo do presente projeto foi determinar características fenotípicas e genotípicas de Enterococcus spp. isolados de amostras de alimentos e águas correlacionando sua presença com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal. De 812 colônias indicativas do gênero enterococos obtidas a partir de 120 amostras de alimentos, 299 isolados (37%) foram presuntivamente caracterizados como Enterococcus spp. Após identificação por PCR, 139 (46,5%) E. faecium, 80 (26,8%) E. faecalis, 36 (12%) E. casseliflavus e 8 (2,7%) E. gallinarum. Produção de gelatinase foi detectada apenas em isolados de E. faecalis (60%). Um isolado de E. faecium (0,7%) e 31 isolados de E. faecalis (38,7%) apresentaram perfil β-hemolítico. Produção de bacteriocina contra Lactobacillus sakei e/ou Listeria monocytogenes foi observada para 10% dos isolados de E. faecalis e 23% dos isolados de E. faecium. Hidrólise de sais biliares foi observada para 100% dos isolados de E. gallinarum, 86% E. casseliflavus, 65% E. faecalis e 62,6% de E. faecium. Alguns isolados de E. faecium apresentaram resistência à vancomicina, eritromicina e tetraciclina. Entre os isolados de E. faecalis não houve resistência à vancomicina, mas foi observada resistência à tetraciclina, eritromicina e alta concentração de gentamicina. Houve uma maior prevalência dos genes de virulência (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) entre os isolados de E. faecalis quando comparado a E. faecium. Além disso, os isolados de E. faecalis, resistentes a antibióticos, mostraram forte adesão a células Caco-2 e capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica. RAPD-PCR individualizou 14 cepas de E. faecium e 17 cepas de E. faecalis dentre os 52 isolados Enterococcus spp. resistentes a antibióticos. A variabilidade dos resultados impediu o estabelecimento de uma correlação entre a presença ou contagem de coliformes, E. coli e enterococos nas amostras analisadas. Os dados deste trabalho sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de virulência, e a presença de cepas resistentes a antibióticos evidenciam a necessidade da avaliação cuidadosa de linhagens de enterococos para aplicações em alimentos. / Enterococcus spp. belong to the group of lactic acid bacteria widely distributed in soil, plants, foods, animals and humans. In the past, these microorganisms were considered commensals but the increase of antibiotic-resistant enterococci and the lack of knowledge about their virulence markers, had raised concerns regarding the safety of using strains of this genus in the food production as fermentative or probiotic cultures. Besides this, literature data suggests the use of enterococci as sanitary indicator for foods. Differences between enterococci strains with pathogenic potential and an apparently safe ones is unclear and there is a concern about virulence markers transfer. The aim of this work was to determine phenotypic and genotypic characteristics of Enterococcus spp. isolated from foods and water and also to correlate their presence with classical indicators of sanitary quality. Out of 812 presumptive enterococci colonies obtained from 120 food samples, 299 isolates (37%) were presuntively characterized as Enterococcus spp. Isolates were identified by PCR: 139 (46.5%) E. faecium, 80 (26.8%) E. faecalis, 36 (12.0%) E. casseliflavus and 8 (2.7%) E. gallinarum. Only E. faecalis isolates (60%) produced gelatinase. One E. faecium (0.7%) and 31 E. faecalis (38.7%) were β-haemolytic. Bacteriocin activity against Lactobacillus sakei and/or Listeria monocytogenes was observed for 10% of the E. faecalis and for 23% of the E. faecium isolates. All E. gallinarum isolates, 86% of the E. casseliflavus, 65% of the E. faecalis and 62.6% of the E. faecium isolates showed bile salt hydrolysis activity. Some E. faecium isolates were resistant to vancomycin, erythromycin and tetracycline. Vancomycin resistance was absent among the E. faecalis but, resistance to tetracycline, erythromycin and highlevel gentamicin was observed. There was a higher prevalence of virulence genes (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) among the E. faecalis isolates when compared to the E. faecium. Antibiotic resistant E. faecalis isolates strongly adhered to Caco-2 cells and formed biofilm on abiotic surface. Using RAPDPCR 14 E. faecium and 17 E. faecalis strains could be individualized from the 52 antibiotic resistant enterococci. It was not possible to correlate the presence of total coliforms, E. coli and Enterococcus spp. in the samples of food and water analysed due to results variability. Data obtained regarding phenotypic and genotypic virulence markers and the presence of antibiotic resistant enterococci raise the needs of a carefully evaluation of the Enterococcus spp. strains before future applications in foods.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:46:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1233057 bytes, checksum: 7aee1afa76fe5f068f40317eabe22e61 (MD5) Previous issue date: 2011-06-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Bovine meat production is a fundamental sector of land business in Brazil. Brazil is the second world producer of beef and the first world exporter, to over one hundred countries worldwide. The preservation of these markets depend on the compliance to a broad set of laws established by the importing countries in order to preserve their herds health, consumer protection and to promote the consolidation of international market relationship. Importers countries legislation have always been a model for development of such norms in Brazil. European laws have always been an important model for Brazil, as Europe has been, until the end of the decade of 1990 the most important importer of Brazilian beef. Still today, even if Europe is no longer the most relevant market for Brazilian bovine meat, it requires attention as it pays more than the others to have Brazilian beef. Generally food safety laws are based on the application of worldwide known procedures such as the good handling procedures (GHP) and the Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP). The guarantee of microbiological safety of exported beef is certified through the direct search for pathogenic microorganisms or through the indirect search for hygiene indicating bacteria. The most commonly searched bacteria are the mesophilic aerobic count (AM), Enterobacteriaceae (EB), total coliforms (CT) and Escherichia coli (EC). For what concerns to pathogenic bacteria, Listeria monocytogenes stands out for its association to beef products and its high pathogenicity. From September, 2009, until November, 2010, we analysed 103 bovine carcasses slaughtered in 3 abattoirs in the state of Minas Gerais. In any carcass we collected swab samples after bleeding (A), after hide removal (B), after evisceration and carcass splitting (C) and after final washing, before chilling (D). The samples were analysed for the counting of indicating bacteria (AM, EB, CT, EC, using Petrifilm platesTM) and for the presence of Listeria spp. And L. monocytogenes, according to ISO 11.290-1 protocol. Those isolates, suspected to be Listeria spp. Were submitted to a multiplex PCR protocol for the confirmation of genus and the identification of L. monocytogenes. All indicating bacteria showed significant different concentration (P < 0,05) between the point A and the followings. AM also showed significant different concentration between point C ant the others (P < 0,05) and CT showed significant differences between points B and C (P < 0,05). We found Listeria spp. In 28 carcasses. Among these, 4 were positive for L. monocytogenes. The contamination for Listeria spp. was significant concentrated at point A (P < 0,05). For the low number of isolates we couldn t find significant contamination points for L. monocytogenes (P > 0,05), even if it was more concentrated at point A than at the others. The indicating bacteria count and the prevalence of Listeria spp. and L. monocytogenes were lower than found in literature, indicating that in the abattoirs we analysed, good hygienic procedures are adopted during slaughtering and carcass processing, helping to obtain a proper reduction of indicating bacteria, Listeria spp. and L. monocytogenes. / A produção de carne bovina é um elemento fundamental do setor agropecuário no Brasil. Atualmente o país é o segundo maior produtor e o primeiro exportador deste alimento para mais de cem países no mundo inteiro. A manutenção desses mercados requer o cumprimento das leis, estabelecidas pelos países importadores, com o fim de proteger a saúde do rebanho, dos consumidores e promover a consolidação dos parceiros comerciais internacionais. As legislações dos países importadores sempre foram um modelo para o desenvolvimento das normas no Brasil. As legislações européias possuem grande destaque, uma vez que a Europa foi principal mercado de carne bovina para o Brasil até a década de 1990. Atualmente a Europa já não é mais o maior importador, mas sempre tem destaque pela alta valorização da carne bovina brasileira. Geralmente as legislações relacionadas à segurança dos alimentos são baseadas na análise dos riscos e na aplicação de ferramentas de controle, como as boas práticas de produção e análise de perigos e pontos críticos de controle. A garantia da segurança microbiológica das carnes exportadas é certificada realizando a pesquisa direta dos patógenos ou a pesquisa indireta, avaliando a contaminação por microrganismos indicadores de higiene. Os grupos microbianos mais frequentemente pesquisados são aeróbios mesófilos (AM), enterobactérias (EB), coliformes totais (CT) e Escherichia coli (EC). Em relação a patógenos, Listeria monoctyogenes possui grande destaque devido a sua alta associação com produtos cárneos e alta patogenicidade. De Setembro de 2009 a Novembro de 2010, foram analisadas 103 carcaças de bovinos abatidos em 3 abatedouros fiscalizados pelo Serviço de Inspeção Federal no estado de Minas Gerais. Em cada carcaça foram coletadas amostras superficiais pela técnica do esfregaço depois da sangria (ponto A), depois da esfola (ponto B), depois da evisceração e divisão da carcaça ao meio (ponto C) e antes da entrada na câmara de refrigeração (ponto D). As amostras foram submetidas a análises microbiológicas para enumeração de microrganismos indicadores de higiene (AM, EB, CT e EC, usando placas Petrifilm ), e pesquisa de Listeria spp. e L. monocytogenes (ISO 11.290-1). Os isolados caracterizados como suspeitos de Listeria spp. foram submetidos a um protocolo de PCR multiplex para confirmação do gênero e identificação da espécie L. monocytogenes. Para todos os microrganismos indicadores enumerados foram verificadas diferenças significativas (P < 0,05) entre as contagens observadas no ponto A e as demais. AM apresentaram diferenças significativas (P < 0,05) de contaminação entre o ponto C e os outros pontos de coleta. CT mostraram diferenças significativas de contaminação (P < 0,05) entre os pontos B e C. Foram encontradas 28 carcaças positivas para Listeria spp. Entre estas, 4 foram positivas por L. monocytogenes. Houve uma significativa concentração da contaminação por Listeria spp. no ponto A (P < 0,05), sem diferenças significativas de contaminação entre os pontos considerando L. monocytogenes (P > 0,05). A ocorrência observada de Listeria spp. e L. monocytogenes foi menor que a observada na literatura consultada, assim como as contagens dos microrganismos indicadores de higiene. Esses resultados indicam que os frigoríficos analisados aplicam procedimentos higiênicos adequados nos processos de abate de bovinos e obtenção de carcaças, auxiliando a redução dos níveis de contaminação por microrganismos indicadores de higiene e ocorrência de Listeria spp. e L. monocytogenes.

Enterococcus spp. pertencem ao grupo das bactérias láticas e estão presentes em solos, águas, plantas, microbiota autóctone de vários alimentos e como membros da microbiota intestinal de humanos e animais. Esses microrganismos foram considerados por muito tempo como comensais, mas o aumento da severidade das infecções nosocomiais causadas por enterococos mutirresistentes a antimicrobianos e, a falta de conhecimento sobre seus fatores de virulência geram insegurança na utilização de cepas deste gênero na produção de alimentos como culturas fermentadoras e/ou probióticas. A diferença entre uma cepa de enterococos com potencial patogênico e outra aparentemente segura para uso em processamento de alimentos não é clara, e a probabilidade de que esta última adquira fatores de virulência merece investigação. O objetivo do presente projeto foi determinar características fenotípicas e genotípicas de Enterococcus spp. isolados de amostras de alimentos e águas correlacionando sua presença com indicadores clássicos de higiene e contaminação fecal. De 812 colônias indicativas do gênero enterococos obtidas a partir de 120 amostras de alimentos, 299 isolados (37%) foram presuntivamente caracterizados como Enterococcus spp. Após identificação por PCR, 139 (46,5%) E. faecium, 80 (26,8%) E. faecalis, 36 (12%) E. casseliflavus e 8 (2,7%) E. gallinarum. Produção de gelatinase foi detectada apenas em isolados de E. faecalis (60%). Um isolado de E. faecium (0,7%) e 31 isolados de E. faecalis (38,7%) apresentaram perfil &#946;-hemolítico. Produção de bacteriocina contra Lactobacillus sakei e/ou Listeria monocytogenes foi observada para 10% dos isolados de E. faecalis e 23% dos isolados de E. faecium. Hidrólise de sais biliares foi observada para 100% dos isolados de E. gallinarum, 86% E. casseliflavus, 65% E. faecalis e 62,6% de E. faecium. Alguns isolados de E. faecium apresentaram resistência à vancomicina, eritromicina e tetraciclina. Entre os isolados de E. faecalis não houve resistência à vancomicina, mas foi observada resistência à tetraciclina, eritromicina e alta concentração de gentamicina. Houve uma maior prevalência dos genes de virulência (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) entre os isolados de E. faecalis quando comparado a E. faecium. Além disso, os isolados de E. faecalis, resistentes a antibióticos, mostraram forte adesão a células Caco-2 e capacidade de formação de biofilme em superfície abiótica. RAPD-PCR individualizou 14 cepas de E. faecium e 17 cepas de E. faecalis dentre os 52 isolados Enterococcus spp. resistentes a antibióticos. A variabilidade dos resultados impediu o estabelecimento de uma correlação entre a presença ou contagem de coliformes, E. coli e enterococos nas amostras analisadas. Os dados deste trabalho sobre marcadores fenotípicos e genotípicos de virulência, e a presença de cepas resistentes a antibióticos evidenciam a necessidade da avaliação cuidadosa de linhagens de enterococos para aplicações em alimentos. / Enterococcus spp. belong to the group of lactic acid bacteria widely distributed in soil, plants, foods, animals and humans. In the past, these microorganisms were considered commensals but the increase of antibiotic-resistant enterococci and the lack of knowledge about their virulence markers, had raised concerns regarding the safety of using strains of this genus in the food production as fermentative or probiotic cultures. Besides this, literature data suggests the use of enterococci as sanitary indicator for foods. Differences between enterococci strains with pathogenic potential and an apparently safe ones is unclear and there is a concern about virulence markers transfer. The aim of this work was to determine phenotypic and genotypic characteristics of Enterococcus spp. isolated from foods and water and also to correlate their presence with classical indicators of sanitary quality. Out of 812 presumptive enterococci colonies obtained from 120 food samples, 299 isolates (37%) were presuntively characterized as Enterococcus spp. Isolates were identified by PCR: 139 (46.5%) E. faecium, 80 (26.8%) E. faecalis, 36 (12.0%) E. casseliflavus and 8 (2.7%) E. gallinarum. Only E. faecalis isolates (60%) produced gelatinase. One E. faecium (0.7%) and 31 E. faecalis (38.7%) were &#946;-haemolytic. Bacteriocin activity against Lactobacillus sakei and/or Listeria monocytogenes was observed for 10% of the E. faecalis and for 23% of the E. faecium isolates. All E. gallinarum isolates, 86% of the E. casseliflavus, 65% of the E. faecalis and 62.6% of the E. faecium isolates showed bile salt hydrolysis activity. Some E. faecium isolates were resistant to vancomycin, erythromycin and tetracycline. Vancomycin resistance was absent among the E. faecalis but, resistance to tetracycline, erythromycin and highlevel gentamicin was observed. There was a higher prevalence of virulence genes (esp, gel, ace, as, efaA e cylA) among the E. faecalis isolates when compared to the E. faecium. Antibiotic resistant E. faecalis isolates strongly adhered to Caco-2 cells and formed biofilm on abiotic surface. Using RAPDPCR 14 E. faecium and 17 E. faecalis strains could be individualized from the 52 antibiotic resistant enterococci. It was not possible to correlate the presence of total coliforms, E. coli and Enterococcus spp. in the samples of food and water analysed due to results variability. Data obtained regarding phenotypic and genotypic virulence markers and the presence of antibiotic resistant enterococci raise the needs of a carefully evaluation of the Enterococcus spp. strains before future applications in foods.