Resumo: A xilanase de Thermoascus aurantiacus codificada pelo gene xynA é uma enzima termofílica com uma promissora aplicação industrial. Neste trabalho, foi realizada a clonagem desse gene, que foi isolado pela técnica de RT-PCR, seguido de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Realizada a caracterização da enzima nativa no extrato bruto do fungo filamentoso assim como da enzima recombinante antes e depois da purificação parcial, a qual foi realizada pelo processo de troca iônica. A atividade ótima das enzimas foi em pH 5,0 e as mesmas foram estáveis diante de ampla faixa de pH (3,5- 10,5, por 24h). Em relação à temperatura ótima e termoestabilidade houve algumas diferenças entre as três condições da xilanase. A xilanase nativa apresentou-se mais ativa a 75°C sendo estável na faixa de 35°C a 75°C após 1 hora de incubação, a xilanase recombinante antes e depois do processo de purificação apresentou temperatura ótima em 60°C, no entanto antes da purificação permaneceu estável entre 35°C e 80°C, e após a purificação entre 35°C e 65°C, em ambos os casos após a incubação por 1 hora. Esse foi o primeiro relato de expressão do gene xynA em P. pastoris. Com a purificação da enzima recombinante serão viabilizados estudos estruturais que requerem grandes quantidades da enzima. Além disso as características observadas de XynA em nossas análises mostraram-se bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico. Nossos dados permitirão então outros estudos para adequação a aplicação dessa xilanase em processos industriais / Abstract: A xilanase de Thermoascus aurantiacus codificada pelo gene xynA é uma enzima termofílica com uma promissora aplicação industrial. Neste trabalho, foi realizada a clonagem desse gene, que foi isolado pela técnica de RT-PCR, seguido de expressão heteróloga em Pichia pastoris. Realizada a caracterização da enzima nativa no extrato bruto do fungo filamentoso assim como da enzima recombinante antes e depois da purificação parcial, a qual foi realizada pelo processo de troca iônica. A atividade ótima das enzimas foi em pH 5,0 e as mesmas foram estáveis diante de ampla faixa de pH (3,5- 10,5, por 24h). Em relação à temperatura ótima e termoestabilidade houve algumas diferenças entre as três condições da xilanase. A xilanase nativa apresentou-se mais ativa a 75°C sendo estável na faixa de 35°C a 75°C após 1 hora de incubação, a xilanase recombinante antes e depois do processo de purificação apresentou temperatura ótima em 60°C, no entanto antes da purificação permaneceu estável entre 35°C e 80°C, e após a purificação entre 35°C e 65°C, em ambos os casos após a incubação por 1 hora. Esse foi o primeiro relato de expressão do gene xynA em P. pastoris. Com a purificação da enzima recombinante serão viabilizados estudos estruturais que requerem grandes quantidades da enzima. Além disso as características observadas de XynA em nossas análises mostraram-se bastante interessantes do ponto de vista biotecnológico. Nossos dados permitirão então outros estudos para adequação a aplicação dessa xilanase em processos industriais / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Fernando Araripe Gonçalves Torres / Banca: Fabio Squina / Banca: Mara Corrêa Lelles Nogueira / Mestre

Resumo: Este trabalho teve como objetivo avaliar a produção de lipase pelo fungo Myceliophthora sp F 2.1.4, por fermentação em estado sólido (FES), fermentação submersa (FS) e fermentação semi-sólida. Alguns testes foram realizados para a obtenção do meio nutricional que melhor proporciona a produção da lipase. Nas condições encontradas foi possível a obtenção de 21 U/mL de lipase na FES, enquanto que para a FS, a produção caiu bruscamente tendo conseguido somente 0,20 U/mL, indicando que a FES foi mais adequada para a produção de lipase por Myceliophthora sp F 2.1.4. As mesmas condições também foram testadas para a fermentação semi-sólida com o uso de buchas vegetais e, dessa forma, a produção enzimática voltou a aumentar com aproximadamente 9 U/mL. A caracterização parcial da lipase produzida pelo fungo Myceliophthora sp. F 2.1.4 por fermentação em estado sólido indicou que a enzima atua em seu máximo em pH entre 5,0 e 7,0 e a temperatura de 35ºC sendo estável entre 35 e 50ºC e em faixa de pH 4,0 e 9,0. A enzima foi sensível a SDS, Al 3+ e Hg 2+ e tolerante a etanol e metanol, solventes utilizados na produção de biodiesel. Quanto à especificidade aos substratos, a lipase apresentou atividade crescente com o aumento da cadeia acila dos substratos sintéticos, conseguindo atuar em substratos com cadeia superior a 10 carbonos, critério utilizado para classificar uma enzima como lipase. Além disso, ela atuou bem em todos os substratos naturais testados, mostrando sua eficiência para aplicações de digestão de óleos. A lipase foi imobilizada em alginato de cálcio e em quitosana sendo possível uma reutilização da enzima por 6 e 12 vezes consecutivas, respectivamente. Estes resultados mostram que as propriedades físico-químicas da lipase de Myceliophthora sp F 2.1.4 possuem um grande potencial para aplicações industriais / Abstract: This study aimed to evaluate the production of lipase by the fungi Myceliophthora sp F 2.1.4, by solid-state fermentation (SSF), submerged fermentation (SmF) and semisolid fermentation. Several tests were made in order to obtain the best nutritional media to lipase production. This conditions were tested for SSF, SmF and semisolid fermentation. The results of the tests showed that for SSF it was possible to obtain 21 U/mL of lipase. On the other hand, for SmF, the production declined brusquely having obtained only 0,20 U/mL, indicating that the SSF was more appropriate for the production of lipase by Myceliophthora sp F 2.1.4 than SmF. In addition, for semisolid fermentation, using loofa sponges, the enzymatic production increased again with approximately 9 U/mL. Partial characterization of lipase produced SSF showed that this enzyme has maximum activity in both pH between 5,0 and 7,0 and temperature of 35 ºC, being stable between 35 and 50 ºC and in range of pH 4,0 and 9,0. The enzyme was sensible to SDS, Al 3+ and Hg 2+ , and tolerant to ethanol and methanol, solvent used for biodiesel production. Regarding the substrate specificity, the tests proved that the enzyme studied seems to be a real lipase since it could act in long-chain substrate. Moreover, it acted effectively for all natural substrates tested, being efficient for applications of oil digestion. Lipase was immobilized in alginate of calcium and chitosan, with the possibility of reuse of 6 and 12 consecutive times, respectively. These results imply that the physicochemical properties of lipase produced by Myceliophthora sp F 2.1.4 make it a great potential for industrial applications / Orientador: Eleni Gomes / Coorientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Maurício Boscolo / Banca: Humberto Márcio Santos Milagre / Mestre

Orientador: Pedro de Oliva Neto / Banca: Dario Abel Palmieri / Banca: Crispin Humberto Garcia Cruz / Resumo: A necessidade mundial por tecnologias não poluidoras ou "limpas" obtidas de fontes renováveis e uso racional da terra, a produção de insumos cada vez mais deverá ser baseada na biotecnologia com emprego de resíduos agroindustriais. A polpa cítrica obtida da laranja (Citrus sinensis) é um importante resíduo que somente no Estado de São Paulo se estima em 7,693x106 toneladas produzidas pelas indústrias cítricas. Este trabalho teve como objetivo principal o estudo da sacarificação biotecnológica e química da polpa cítrica. A produção de extrato bruto enzimático usando a polpa cítrica proveniente da indústria cítrica foi estudada para a produção de celulases e poligalacturonases por fermentação em processo de batelada simples com reciclo de células e caldo usando os fungos Trichoderma reesei e Aspergillus niger. O resíduo proveniente dessa fermentação foi avaliado quanto à proteína bruta incorporada durante a fermentação. A polpa cítrica se mostrou um substrato eficiente na produção enzimática. Neste trabalho a atividade de poligalacturonase atingiu o pico de produção de 8,05 UI/mL com 72 h. de cultivo em seu terceiro ciclo com 12% de polpa cítrica, usando como inoculante o A. niger. Já a produção de celulase ocorreu tanto com o A. niger quanto com o T. reesei, com picos de 0,57 e 0,72 FPU/mL respectivamente. Quanto ao enriquecimento proteico da polpa cítrica após o cultivo com A. niger e T. reesei houve uma elevação de 7,97% para 22,8% e 26,8% respectivamente, através do processo com reciclo da biomassa e caldo fermentativo. Um estudo comparativo de sacarificação da polpa cítrica por via ácida também foi feito com 0,1% de H2SO4 a 121ºC e 1 atm em diferentes tempos. Os melhores tempos foram de 60 e 120 min. com... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The global need for clean technologies, renewable, and efficient use of land, more and more production will be based on the use of biotechnology with agribusiness residues. The citrus pulp obtained from orange (Citrus sinensis) is an important residue that only in the State of São Paulo is estimated at 7.693 x 106 tonnes produced by the citrus industry. This study aimed the evaluation of the biotechnological and chemical saccharification of citrus pulp peel. The production of crude enzyme extract using citrus pulp from the citrus industry has been studied to produce cellulase and polygalacturonase by fermentation in a simple batch procedure with cell and broth recycle using the fungi Trichoderma reesei and Aspergillus niger. The fermented residues were evaluated for the incorporated protein during fermentation. The citrus pulp proved to be an efficient substrate in enzyme production. In this work the results of polygalacturonase production peaked at 8.05 U/mL in 72 h. cultivation in its third cycle with 10% citrus pulp, using as inoculum A. niger. The production of cellulase occurred both with A. niger and T. reesei with, with peaks of 0.57 and 0.72 FPU/mL, respectively. As for the protein enrichment of citrus pulp after cultivation with A. niger and T. reesei there was an increase of 7.97% to 22.8% and 26.8%, respectively, through the process with recycling of biomass and fermented broth. A comparative study of the citrus pulp saccharification by acid was also done with 0.1% H2SO4 at 121 °C and 1 atm at different times. The best times were 60 and 120 min. with 43.8 grams of sugar and 42.1 respectively per 100 g of dried citrus pulp. This technique is fast and efficient, but the cost was not competitive when compared to the cost of sucrose from sugar cane. But the use of citrus pulp as a substrate for production... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Cláudio Thoméo / Banca: José Teixeira Freire / Banca: Maria Aparecida Mauro / Resumo: O objetivo geral deste trabalho foi contribuir no projeto de um biorreator rotativo para aplicação de Fermentação em Estado Sólido (FES), visando à produção do fungo entomopatogênico M. anisopliae, empregando arroz como substrato. O desenvolvimento do projeto foi realizado em duas etapas. A primeira etapa consistiu em visualizar a homogeneidade e a movimentação de partículas de arroz, em um protótipo construído em acrílico. Isto, com o objetivo de avaliar as melhores configurações dos componentes internos do reator. O método empregado na análise de homogeneidade foi a técnica de traçadores coloridos, utilizando uma concentração de 10% em massa de arroz tingido de preto e 90% de arroz branco. A concentração da mistura foi determinada de duas maneiras: (i) manualmente, por separação e pesagem das amostras e, (ii) por análise de imagem mediante o software Lenseye (E&CS Programs). Além disso, foram determinadas as velocidades das partículas em três regiões do leito: na superfície, centro do leito e do lado da parede do cilindro, e foram estabelecidos os regimes de escoamento e os graus de enchimento trabalhados. As variáveis estudadas foram massa total de arroz (5, 10 e 15 Kg), velocidade de rotação (1, 4 e 7 RPM) e a presença e ausência de tubos simuladores de alimentação dentro do tambor. Posteriormente, no mesmo equipamento, foi analisada a molhabilidade do leito, por determinação da umidade em três pontos do leito, na seção longitudinal do tambor. O material particulado empregado nestes experimentos foram esferas de sílica gel de 6mm de diâmetro. As variáveis avaliadas foram quantidade de água aspergida (0,1 e 0,05 mL/g material), vazão de água (1600, 2000 e 2400 mL/min) e carga total de material (5,8 e 12,6 Kg). A segunda etapa consistiu em analisar o comportamento térmico do reator, empregando o equipamento construído em aço... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work is aimed to contribute to the development of a rotary drum bioreactor for Metarhiziun anisopliae spore production by Solid State Fermentation, using rice as a substrate. This work is comprised of two parts, one corresponding to particle moving analysis and another on thermal aspects. The first part assesses both the mixture and the movement of particles of rice in a Plexiglas rotary drum, in order to identify the optimal operational conditions for the best particle mixture. Tracer method was applied to assess the particle mixture and two techniques were applied to assess the mixture: manual sampling and image analysis using Lenseye (E&CS Programs) software. The flow regime and particle velocities were also identified by filming the bed while rotating. For particle measurements three regions were analyzed: wall, core and surface. Rice load (5, 10, and 15 kg), rotation velocity (1, 4, and 7 RPM), and the presence or absence of inner tubes within the bed were the independent variables for all the tests. Afterwards, the bed wetability was analyzed in the same equipment, using 6mm diameter silica gel particles. Water was sprinkled over the particles in three axial positions. The selected variables were the volume of water by the bed mass ratio (0,1 and 0,05 mL/g), the water flow rate (1600, 2000, and 2400 mL/min), and the particle load (5,8, and 12,6 kg). The second part assessed the thermal behavior of a glass beads bed, 3mm diameter, in a stainless steel rotary drum. The main purpose of this step was to identify the optimal operational conditions for the best thermal homogeneity. The selected variables were the air flow rate, the bed load, and the rotational conditions (static or mobile). From the first part, the results showed that a complete mixture was obtained after 5, 9, and 11 drum revolutions for 5, 10, and 15 kg loads, respectively, independently from the tracer... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Roberto da Silva / Banca: Adriane Maria Ferreira Milagres / Banca: Heloisa Ferreira Alves do Prado / Resumo: A ciclodextrina glicosiltransferase (CGTase) é uma enzima microbiana que converte o amido em ciclodextrinas (CDs). Estes compostos são moléculas cíclicas, formadas por monômeros de D-glicoses unidas por ligações glicosídicas do tipo a-1,4. As CDs podem ser uma alternativa para controlar o escurecimento de batatas e frutas devido a sua capacidade de formar complexo de inclusão com substratos da reação de escurecimento. Alimentos contendo amido, quando adicionados da CGTase são também, potencialmente capazes de sofrer a ação da enzima formando CD localmente. Esse trabalho teve por finalidade estudar a aplicação direta da enzima CGTase em batatas e a aplicação de ciclodextrina comercial em batatas, maçãs, bananas e pêras visando controlar as reações de escurecimento enzimático ou não enzimático, destes alimentos. A formação de complexos com ciclodextrina foi determinada por calorimetria diferencial de varredura (DSC). Este trabalho mostrou pela primeira vez que tanto a CGTase produzida por Bacillus clausii E16 quanto a CGTase comercial (Toruzyme., Novozymes), foram capazes de controlar o escurecimento químico de batata e enzimático de batata e maçã. A utilização da CD mostrou efeito similar a ação das CGTases para batata e maçã, reduzindo dessa forma o escurecimento enzimático causado pela enzima polifenoloxidase. Pode-se inferir que ocorreu a produção da CD pela ação da CGTase em presença do substrato natural (amido de batata e maçã) e por conseqüência sua ação complexante junto aos agentes responsáveis pelo escurecimento, inibindo assim a efetivação das reações. Essa possível encapsulação foi demonstrada pela análise de DSC referente à diminuição do pico da amostra de batata tratada com CGTase. / Abstract: The cyclodextrin glycosyltransferase (CGTase) is a microbial enzyme that converts starch to cyclodextrins (CDs). These compounds are cyclical molecules, formed by D-glucose monomers linked by a-1,4-glycosidic linkages type. The CDs can be an alternative to control the potato and fruits browning due its capacity to form complexes of inclusion with substrate of the browning reaction. Foods containing starch, when added of the CGTase are also potentially able to the action from the enzyme, then forming CD. This work had the purpose to study the direct application of the CGTase enzyme in potatoes and the commercial cyclodextrin application in potatoes, apples, bananas and pears aiming to control the browning enzymatic or no enzymatic reactions of these foods. The cyclodextrin complexes formation was determined by differential scanning calorimetry (DSC). This work showed for the first time that as the CGTase produced for Bacillus clausii E16 as the commercial CGTase (Toruzyme., Novozymes), were capable to control the chemical browning of potato and enzymatic browning of potato and apple. The use of the CD showed to similar effect to the action of CGTases for potato and apple, reducing in both the enzymatic browning caused by polyphenoloxidase enzyme. It can be concluded that the production of CD occurred by CGTase action in presence of the natural substrate (starch of potato and apple) and for consequence it’s action to form complexes next to the responsible agents for the browning, thus inhibiting effectively the reactions. This possible encapsulation was demonstrated by analysis of DSC referring to the reduction of the peak of the potato sample treated with CGTase. / Mestre