Efferocytosis, the clearance of apoptotic cells including apoptotic neutrophils by macrophage phagocytosis, is a key cellular mechanism for resolution of inflammation and tissue repair. Cyclin-dependent kinases (CDKs) 7 and 9 phosphorylate RNA polymerase II that is vital for neutrophil transcriptional capacity. CDK inhibitors such as R-roscovitine, and the more selective inhibitor AT7519, induce neutrophil apoptosis and promote resolution of several mouse models of inflammation including acute lung inflammation. The hypothesis investigated here was that AT7519 would promote neutrophil apoptosis (i) in the infarcted heart, leading to macrophage polarisation, angiogenesis, reduced infarct expansion and retention of cardiac function and (ii) in the peritoneum, enhancing resolution of sterile peritonitis. AT7519 (1μM) induced apoptosis of mouse unstimulated-bone marrow derived neutrophils and thioglycollate-stimulated neutrophils in vitro in a time- and caspase-dependent manner, but did not alter activation assessed by calcium flux in response to the synthetic formyl peptide (fMLF) or platelet-activating factor (PAF). Only high concentrations of AT7519 (10 μM) induced monocyte/macrophage apoptosis and this was likely due to saturated phagocytosis of apoptotic neutrophils induced by high concentration of AT7519. Myocardial infarction (MI) was induced by coronary artery ligation in adult male mice and infarct volume was assessed 7 or 21 days later by in vitro optical projection tomography (OPT). The novel use of OPT for this purpose was validated by demonstrating correlation with infarct volume obtained by late-gadolinium enhanced magnetic resonance imaging in vivo and with infarct area assessed by histological staining (Masson’s Trichrome) in tissue sections. AT7519 (30 mg/kg i.p.) increased the number of apoptotic neutrophils (cleaved caspase-3 and Ly6G +ve) in the heart when administered after MI, but this was not associated with any subsequent alteration in macrophage polarisation, vessel density, infarct expansion or structural and functional remodelling of the left ventricle. In contrast, induction of neutrophil apoptosis by AT7519 (30mg/kg i.p.) successfully promoted macrophage polarisation and the resolution of inflammation associated with peritonitis elicited by either 10% thioglycollate or by 1mg zymosan. AT7519 treatment also reduced the number of CD19+ B cells, Foxp3+CD4+ T cells and eosinophils in peritoneal lavage, and prolonged the phase of monocyte recruitment in zymosan-induced peritonitis. In conclusion, AT7519 successfully induced mouse neutrophil apoptosis in vitro, as well as in vivo in experimental MI and peritonitis. Subsequent promotion of inflammation resolution in peritonitis was not matched by improved outcome following MI. Unexpected effects of CDK inhibition on monocytes, T cells and eosinophils that are necessary for myocardial infarct repair may have compromised any beneficial effects resulting from promotion of in situ neutrophil apoptosis. CDK inhibition may therefore have therapeutic potential for the treatment of peritonitis, but not for prevention of infarct expansion and detrimental ventricular remodelling after MI.

Le diabète non insulino-dépendant de type 2 demeure un problème majeur de santé publique. Cette pathologie associée au vieillissement, à la sédentarisation et à l'obésité induit un taux élevé de complications. Parmi celles-ci, le défaut de cicatrisation et plus particulièrement le syndrome du " pied diabétique " est une des causes majeures de morbidité et de mortalité chez les patients diabétiques. La compréhension de la dérégulation des mécanismes cellulaires et moléculaires du processus cicatriciel chez le diabétique représente un enjeu essentiel pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. C'est dans ce contexte que ce travail de thèse a été réalisé. La cicatrisation des plaies est un processus physiopathologique complexe, multifactoriel et dynamique visant à rétablir l'intégrité et la fonctionnalité des tissus lésés. Cette réponse biologique nécessite une orchestration et une communication précise entre les cellules inflammatoires infiltrées et les différentes populations cellulaires des tissus. De manière conventionnelle, on distingue 4 principales phases qui peuvent se chevaucher : une première étape d'hémostase généralement couplée à une phase inflammatoire précoce et arrêtée par une phase de résolution de l'inflammation. Une période de prolifération/ régénération permet la génération du nouveau tissu, et enfin, la phase de remodelage tissulaire permet au tissu de retrouver des caractéristiques d'élasticité et de souplesse proche du tissu original. Les données de la littérature suggèrent que le retard de cicatrisation des personnes diabétiques résulterait de la chronicité de la phase inflammatoire. Notre hypothèse de travail a été de démontrer que cette dérégulation était la conséquence d'un défaut majeur de la phase de résolution de l'inflammation. Notre objectif final a été d'agir sur cette phase pour accélérer le processus cicatriciel. La première étape de ce travail de thèse a consisté à mettre en place un modèle de lésions cutanées par excision chez des souris diabétiques de type 2 (en régime hyper lipidique ou déficientes pour le récepteur de la leptine, db/db). Ce modèle expérimental, combiné à la mise au point d'un dispositif médical innovant nous a permis (i) de recueillir stérilement les cellules et l'exsudat produit au niveau de la lésion cutanée, (ii) d'évaluer les caractéristiques phénotypiques et fonctionnelles des cellules de l'exsudat et (iii) d'évaluer le taux des médiateurs pro- et anti-inflammatoires au cours du temps. L'ensemble de ce travail a pu être réalisé en préservant l'environnement du tissu cicatriciel. Cette première étape a débouché sur le dépôt de 2 brevets en décembre 2011 (FR 2984719 - FR 2984722) suivi de leur extension Européenne l'année suivante. Cette approche expérimentale nous a permis de démontrer que la dérégulation du processus cicatriciel de souris diabétiques de type II était due, à une forte infiltration au niveau de la lésion de polynucléaires neutrophiles, de macrophages inflammatoires M1 et à un défaut d'afflux de macrophages anti-inflammatoires M2. Tout cela était associé à un défaut d'apoptose des cellules inflammatoires et de leur efférocytose. Ces dérégulations signent un défaut de résolution de l'inflammation que nous avons pu valider par la mise en évidence au niveau de l'exsudat inflammatoire et du tissu cicatriciel d'un excès de leucotriène B4 (LTB4) (métabolite de l'acide arachidonique pro-inflammatoire provenant de la voie de la 5-lipoxygénase) au dépend de la lipoxine A4 (LXA4) (métabolite de l'acide arachidonique anti-inflammatoire produit par les voies des 5-LOX et 12/15-LOX). Ces résultats acquis, nous nous sommes attachés à cibler, par une approche pharmacologique originale, la phase de résolution de l'inflammation pour favoriser la fermeture des plaies des souris diabétiques. / Non-insulin dependent type 2 diabetes is a major public health problem due to its prevalence and the high rate of its degenerative complications. Among these problems, healing disorders and more particularly "diabetic foot" ulcers are one of the leading cause of morbidity and mortality of diabetic patients. The understanding of the deregulation of cellular and molecular mechanisms of the wound healing process in diabetic patients is a key issue for the development of new therapeutic strategies. This work was carried out in this context. Wound healing is a physiological multifactorial and dynamic process aiming to the restoration of the integrity and functionality of injured tissue. This complex biological response requires an orchestration and a precise communication between immuno-inflammatory cells and resident cells in the wound tissue. This process can be divided into four distinct but overlapping phases: an inflammatory phase involving the initial stage of hemostasis arrested by a resolution phase of inflammation; a proliferative/regeneration stage and finally a tissue remodeling phase. Data from the literature suggest that the delayed healing in diabetic patient is principally due to chronic inflammation. Our hypothesis was to demonstrate that deregulation was the result of a major impairment of the resolution phase of inflammation. Our ultimate aim was to influence this phase to accelerate the healing process in diabetic mice. The first step of this study was to develop a new cutaneous excisional wound model in type 2 diabetic mice (in High Fat Diet or leptin receptor deficiency mice db/db). Associated with the development of an innovative device, this model allowed us (i) to treat the wound and follow the wound healing evolution (ii), to collect in aseptically condition and over time the secreted exudate, (ii) to evaluate the phenotypic and functional characteristics of exudate cells and to measure the amount of pro-and anti -inflammatory mediators. This first step leads to the publication of two patent applications (filed in December 2011 and published under the references FR 2984719 and FR 2984722). Our experimental approach demonstrate that the impaired wound healing process in type 2 diabetic mice was due to a strong neutrophil and inflammatory macrophage M1 infiltration, and a lack of influx of anti-inflammatory macrophages M2. All this is associated with a failure in the inflammatory cells apoptosis and efferocytosis. These dysregulations sign a default of resolution of inflammation that we have quantified by the measure of excessive leukotriene (LT) B4, (a proinflammatory arachidonic acid (AA) metabolite from the 5-lipoxygenase pathway) in both exudate and scar tissue, at the expense of the lipoxin (LX) A4 (an anti-inflammatory AA metabolite formed from LTA4 by 12/15-LOX). With an original pharmacological approach, we target the resolution of the inflammatory phase to promote wound closure in diabetic mice. For this we have decided to use topical application of acetylsalicylic acid on the wound (AAS-aspirin), 3 days after the establishment of the skin lesion. We demonstrate that aspirin accelerates wound closure in diabetic mice.