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[ES] La presente tesis doctoral titulada "Nanomateriales con puertas moleculares como plataforma de liberación controlada de fármacos para el tratamiento de desórdenes inflamatorios" se centra la preparación y evaluación de nanomateriales híbridos orgánico-inorgánicos, basados en nanopartículas mesoporosas de sílice, para la liberación controlada de fármacos en aplicaciones biomédicas, en concreto en el campo de la inflamación. En primer lugar se describe un nanomaterial para la liberación controlada del inhibidor de caspasa-1, VX-765, aprovechando la acumulación preferencial de las nanopartículas en las zonas inflamadas. En concreto, se han preparado nanopartículas mesoporosas de sílice, cargadas con el fármaco VX-765 y funcionalizadas covalentemente con ¿-poli-L-lisina que actúa como puerta molecular. La actividad anti-inflamatoria del material se ha comprobado tanto in vitro, en el modelo celular de monocitos THP-1, como in vivo en ratones en un modelo de inflamación de bolsa de aire. Los resultados muestran la acumulación preferente de las nanopartículas en las zonas inflamadas así como un aumento del efecto terapéutico del fármaco que se atribuye a las ventajas que ofrece la encapsulación. Se concluye que las nanopartículas mesoporosos de sílice con puertas moleculares podrían ser una herramienta importante para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en el campo de la inflamación. Basándonos en los resultados obtenidos, en el capítulo cuatro se describe un sistema de liberación controlada para el tratamiento de la inflamación pulmonar aguda como terapia alternativa que permita la administración directa de fármacos a los pulmones. Se ha preparado un nanosistema basado en nanopartículas mesoporosas de sílice cargadas con el glucocorticoide dexametasona y funcionalizadas covalentemente con una puerta molecular peptídica que reconoce el receptor del factor de necrosis tumoral 1 (TNFR1), que a su vez actúa como agente diana para la acumulación preferente en macrófagos pro-inflamatorios. La actividad terapéutica del sistema se ha corroborado en ensayos in vitro en macrófagos pro-inflamatorios, e in vivo en un modelo de ratón de inflamación pulmonar aguda. Se ha comprobado la acumulación preferente de las nanopartículas en los pulmones inflamados, así como la mejora del efecto terapéutico de la dexametasona en la reducción del daño pulmonar, minimizando los efectos adversos asociados a la administración del fármaco libre. Con todo ello se concluye que las nanopartículas mesoporosas de sílice pueden ser utilizadas para el tratamiento de la inflamación pulmonar aguda pudiendo ser una herramienta útil para superar las limitaciones de los tratamientos actuales. Finalmente, se describe otro sistema de liberación controlada de fármacos para inflamación pulmonar aguda. En este caso, se aborda el uso de un nuevo inhibidor del inflamasoma, QM-378, como terapia farmacológica alternativa. Con el objetivo de potenciar la administración directa en los pulmones inflamados, el QM-378 se encapsula en nanopartículas mesoporosas de sílice funcionalizadas con la puerta molecular peptídica que reconoce TNFR1. La acumulación preferente de las nanopartículas en los pulmones inflamados queda demostrada a través de los ensayos de biodistribución, así como la mejora del efecto terapéutico del QM-378 en la reducción del daño pulmonar, debido a las ventajas de la encapsulación en un nanosistema dirigido. Con todo ello se concluye que el QM-378 es un buen candidato para el tratamiento de la inflamación pulmonar aguda, y que su encapsulación en las nanopartículas ofrece una administración pulmonar directa y controlada, consiguiéndose así una mejora en el perfil terapéutico del fármaco. La conclusión principal de la presente tesis doctoral es que el desarrollo de nanomateriales mesoporosos de sílice para la liberación controlada de fármacos se presenta como un / [CAT] La present tesi doctoral titulada "Nanomaterials amb portes moleculars com a plataforma d'alliberament controlat de fàrmacs per al tractament de desordres inflamatoris" se centra en la preparació i avaluació de nanomaterials híbrids orgànic-inorgànics, basats en nanopartícules mesoporoses de sílice, per a l'alliberament controlat de fàrmacs en aplicacions biomèdiques, en concret en el camp de la inflamació. En primer lloc, es presenta un nanomaterial per a l'alliberament controlat de l'inhibidor de caspasa-1, VX-765, aprofitant que les nanopartícules s'acumulen preferencialment en les zones inflamades. S'han preparat nanopartícules mesoporoses de sílice, carregades amb VX-765 i funcionalitzades covalentment amb ¿-poli-L-lisina com a porta molecular. L'activitat anti-inflamatòria del material s'ha comprovat tant in vitro, en el model cel·lular de THP-1, com in vivo en ratolins en un model d'inflamació de bossa d'aire. Els resultats mostren la acumulació preferent de les nanopartícules en les zones inflamades així com un augment de l'efecte terapèutic del fàrmac, atribuÏt als avantatges que ofereix l'encapsulació. Es conclou que les nanopartícules mesoporoses de sílice amb porta molecular podrien ser una eina important per al desenvolupament de noves estratègies terapèutiques en el camp de la inflamació. Basant-nos en els resultats obtinguts, en el capítol quatre es presenta un sistema d'alliberament controlat per al tractament de la inflamació pulmonar aguda com a teràpia alternativa que permet l'administració directa de fàrmacs als pulmons. S'ha preparat un nanosistema basat en nanopartícules mesoporoses de sílice carregades amb el glucocorticoide dexametasona i funcionalitzades amb la unió covalent de una porta molecular peptídica que reconeix el receptor del factor de necrosi tumoral 1 (TNFR1), que al seu torn actua com a agent diana per a la acumulació preferent en macròfags pro-inflamatoris. L'activitat terapèutica del sistema dissenyat s'ha corroborat en assajos in vitro en macròfags pro-inflamatoris, i in vivo en un model de ratolí d'inflamació pulmonar aguda. S'ha comprovat la acumulació preferent de les nanopartícules en els pulmons inflamats a través d'assajos de biodistribució, així com la millora de l'efecte terapèutic de la dexametasona en la reducció de la lesió pulmonar minimitzant els efectes adversos associats a l'administració del fàrmac lliure. Amb tot això es conclou que les nanopartícules mesoporoses de sílice poden ser utilitzades per al tractament de la inflamació pulmonar aguda ja que poden ajudar a superar les limitacions dels tractaments actuals. Finalment es mostra també un sistema d'alliberament controlat de fàrmacs per a inflamació pulmonar aguda. En aquest cas, es descriu l'ús d'un nou inhibidor de l'inflamasoma, QM-378, com a teràpia farmacològica alternativa al tractament de la inflamació descontrolada en la inflamació pulmonar aguda. Amb l'objectiu de potenciar l'administració directa en els pulmons inflamats, el QM-378 s'encapsula en les nanopartícules mesoporoses de sílice funcionalitzades amb la porta molecular péptidica que reconeix TNFR1. La acumulació preferent de les nanopartícules en els pulmons inflamats queda demostrada a través dels assajos de biodistribució, així com la millora de l'efecte terapèutic del QM-378 en la reducció de la inflamació pulmonar, atribuït als avantatges de l'encapsulació en un nanosistema dirigit. Amb tot això es conclou que el QM-378 és un bon candidat per al tractament de la inflamació pulmonar aguda, i que la seua encapsulació en les nanopartícules ofereix una administració pulmonar directa i controlada aconseguint-se així una millora en el perfil terapèutic del fàrmac. La conclusió principal és que el desenvolupament de nanomaterials mesoporosos de sílice per a l'alliberament controlat de fàrmacs es presenta com una estratègia amb molt potencial en el camp de les / [EN] This PhD thesis entitled "Gated nanomaterials as delivery platform to manage inflammatory disorders" is focused on the design, synthesis and evaluation of hybrid organic-inorganic nanomaterials using mesoporous silica nanoparticles, for controlled drug release in biomedical applications, specifically in the field of inflammation. In a fist step, we present a new nanodevice for the controlled delivery of VX-765, a caspase 1 inhibitor, which takes advantage of the intrinsic passive targeting effect of the nanoparticles to inflamed tissues. In particular, mesoporous silica nanoparticles loaded with the drug VX-765 and functionalized with ¿-poly-L-lysine (acting as gatekeeper) have been prepared. The anti-inflammatory activity of the prepared nanodevice has been evaluated both in vitro, in the cellular model of monocytes THP-1, and in vivo using air pouch mouse as model of inflammation. The results showed the preferential accumulation of the nanoparticles in the inflamed tissue, as well as an increase in the therapeutic effect of the entrapped drug. As conclusion, gated mesoporous silica nanoparticles constitute an important tool for the development of new therapeutic strategies in the inflammatory field. Based on the previous results presented, a drug delivery system for the treatment of acute lung injury is described in chapter four as alternative therapy that allow the direct delivery of drugs into the lungs. Mesoporous silica nanoparticles has been prepared, loaded with the glucocorticoid dexamethasone and capped with a peptide gatekeeper that recognizes the receptor of tumour necrosis factor 1 (TNFR1), which also targets the pro-inflammatory macrophages. The therapeutic activity of the designed nanoparticles has been studied in vitro in pro-inflammatory macrophages, and in vivo in an acute lung injury mouse model. The preferential accumulation of the nanoparticles in the inflamed lungs has been corroborated through biodistribution assays, as well as the ability to enhance the dexamethasone therapeutic effect by the reduction of lung injury and minimizing the undesired side effects associated of the free drug administration. As conclusion, gated mesoporous silica nanoparticles can be used for the treatment of acute lung injury and represent a potential tool to overcome the limitations of current treatments. Finally, a drug delivery system for acute lung injury is also presented. In this case, we use the novel inflammasome inhibitor QM-378 as pharmacological alternative therapy to the treatment of uncontrolled inflammation in acute lung injury. With the aim of enhancing the direct drug delivery in lungs, QM-378 is encapsulated in mesoporous silica nanoparticles capped with a peptidic gate that recognizes TNFR1. The preferential accumulation of nanoparticles to inflamed lungs has been also corroborated through biodistribution assays. An enhancement of the therapeutic effect of QM-378 by reducing lung inflammation is demonstrated, due to the advantages of drug encapsulation in a targeted-lung nanosystem. As conclusion, the QM-378 is a suitable candidate for acute lung injury treatment, and its encapsulation in mesoporous silica nanoparticles offers a direct lung drug delivery thus improving the therapeutic profile of the drug. The principal conclusion from this PhD thesis is that the preparation of mesoporous silica nanoaprticles for drug delivery is presented as potential strategy in the field of inflammatory disorders. / García Fernández, A. (2019). Gated nanomaterials as delivery platform for the treatment of inflammatory disorders [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/132694 / TESIS

Aux côtés des formes dites classiques de Sclérose en plaques (SEP), un nombre important de patients présentent des caractéristiques atypiques qui vont être responsable d’une période, parfois longue, d’errance diagnostique. Certains de ces patients, malgré les atypies, font clairement partie du spectre de la SEP tandis-que d’autres présentent probablement des maladies inflammatoires démyélinisantes idiopathiques distinctes qui sont, à ce jour, toujours en attente d’individualisation.Les objectifs principaux de ce travail de thèse étaient de mieux caractériser ces formes atypiques de SEP et autres maladies inflammatoires démyélinisantes idiopathiques.Nous avons effectué un travail rétrospectif de caractérisation clinique et radiologique (sur les données d’IRM acquises en conditions de vie réelle) afin d’aider au diagnostic et à mieux définir le pronostic évolutif de ces patients. Nous avons également effectué une analyse anatomopathologique chez les patients présentant une lésion inflammatoire nécessitant une biopsie avec pour objectif de mieux positionner ces lésions au sein du spectre de la SEP et du spectre des Neuromyélites Optiques (NMOSD). Enfin nous avons effectué une caractérisation de l’expression astrocytaire du récepteur NKp46 au sein des lésions de SEP et des lésions inflammatoires démyélinisantes atypiques.Les principaux résultats sont :1) En l’absence d’autre lésion cérébrale évocatrice de SEP, le risque de développer une SEP cliniquement définie chez un patient présentant une lésion cérébrale inflammatoire démyélinisante isolée est faible.2) La SEP, notamment dans sa forme progressive, peut avoir des caractéristiques proches de celles rencontrées dans le cadre des léucoencéphalopathies héréditaires. Dans ces situations, l’analyse des lésions de la substance grise, de la topographie des lésions de la substance blanche et le caractère nodulaire (>3mm mais non diffus) sont en faveur du diagnostic de SEP.3) Les lésions inflammatoires démyélinisantes du système nerveux central sont extrêmement hétérogènes en IRM. Néanmoins, certaines caractéristiques leurs sont communes : liseré périphérique en hypersignal en diffusion, prise de contraste périphérique ouverte, respect de la substance grise. L’analyse anatomopathologique sur tissus provenant de biopsies réalisées pour incertitude diagnostique démontre une préservation quasi systématique du marquage AQP4.4) L’expression astrocytaire de NKp46, récepteur classiquement décrit comme spécifique des lymphocytes NK, est commune à de nombreuses conditions neuroinflammatoires et neurodégénératives y compris la SEP, les NMOSD et les autres maladies inflammatoires démyélinisantes. Nous n’avons, à ce jour, pas pu déterminer l’implication du récepteur NKp46 dans la réponse astrocytaire en conditions inflammatoires.En conclusion, l’étude de notre cohorte rétrospective multicentrique a permis de mieux préciser les caractéristiques clinique (y compris de suivi), anatomopathologiques et IRM de patients présentant des formes atypiques de SEP et de maladies inflammatoires démyélinisantes.L’identification de sous-types de SEP caractérisés par une atteinte extrêmement sévère tant sur le plan clinique que radiologique nous semble pouvoir être un modèle d’étude intéressant dans la recherche de biomarqueurs d’imagerie et biologiques de la maladie. / Beside classical multiple sclerosis (MS), a significant proportion of patients can present some atypical clinical or radiological characteristics that will lead to diagnostic uncertainties. On one side, some of these patients belong to MS spectrum whereas some other probably have yet unidentified inflammatory demyelinating disorders.Our objectives were to describe those patients with atypical MS and atypical idiopathic inflammatory demyelinating disorders.We retrospectively gathered clinical and radiological (in a real-life setting) data from patient to better delineate diagnostic clues and to better assess prognosis of these patients. Moreover, a neuropathological analysis of patients’ tissue collected for diagnostic uncertainties was performed to assess AQP4 staining in patients with acute atypical inflammatory demyelinating disease. Finally, we characterized the expression of the activating receptor NKp46 within astrocytes in MS and other inflammatory neurological diseases.Our main results were the following:1) in the absence of any other lesion suggestive of MS, the overall risk of MS diagnosis and typical MS relapse is low.2) MS, notably primary progressive or bout-onset MS, can share MRI characteristics with inherited leukoencephalopathies and leukodystrophies. In this context, a thorough analysis of deep and cortical gray matter, topography of white matter lesions and size (typically nodular > 3mm but not confluent) strongly argues in favor of MS.3) In spite of a marked heterogeneity of central nervous system inflammatory demyelinating lesions, some characteristics such as a peripheral B1000 hyperintensity with open rim gadolinium enhancement (with or without central enhancement) and gray matter sparing are common to all of these conditions. Moreover, neuropathological analysis of these lesions suggests a systematic normal/increased AQP4 staining.4) NKp46 astrocytic expression, a classical NK cells marker is common to several neuroinflammatory diseases including MS, NMOSD and other inflammatory demyelinating disorders. To date, we were not able to ascertain NKp46 involvement in the context of neuroinflammation.To conclude, our analysis enabled to refine clinical, neuropathological and MRI characteristics of patients with atypical MS and atypical inflammatory demyelinating disorders.The identification of “clusters” of atypical MS with dramatic disability progression and early evidence of neurodegeneration should allow us to identify promising MRI and/or biological biomarkers of disease progression.

Le dysfonctionnement de l'exocytose des granules cytotoxiques est responsable d'une susceptibilité accrue aux pathogènes intracellulaires qui s'accompagne de l'activation continue et anarchique des lymphocytes cytotoxiques et des macrophages. Ce phénomène conduit à la lymphohistiocytose hémophagocytique (HLH), un syndrome auto-inflammatoire fatal en absence d'intervention thérapeutique. Les mutations des gènes codant pour la perforine (PRF-1) ou pour certaines des protéines impliquées dans la biogénèse ou le transport vésiculaire des granules cytotoxiques sont causales des formes familiales ou primaires de la HLH (FHL). La HLH fait également partie des complications secondaires aux infections à herpesviridae et à certains désordres immunologiques importants tels que l'arthrite juvénile idiopathique (SoJIA). Au moment d'entreprendre les travaux présentés dans ce manuscrit, le premier cas de HLH induite par une mutation menant à l'activation constitutive de la composante NLRC4 de l'inflammasome était décrit. L'inflammasome est une structure multimérique composée d'un récepteur cytosolique, de la protéine échafaud ASC et de la Caspase-1. Son activation mène à la maturation des pro-formes de l'IL-1β et l'IL-18 ainsi qu'à leur sécrétion. L'activation constitutive de NLRC4 étant suffisante au déclenchement de la HLH, nous avons tenté de comprendre si cette structure y était essentielle dans le cadre des défauts génétiques de cytotoxicité. Nous avons donc invalidé la protéine ASC ou Caspase-1 dans le modèle murin de HLH déficient pour la perforine (PRF1 -/-). Nous avons également testé l'hypothèse qu'un déficit de cytotoxicité pouvait expliquer le développement de la HLH chez les patients souffrant de SoJIA. Nos résultats montrent que l'inflammasome est nécessaire à la production d'IL-18 lors de la HLH mais qu'il n'est pas essentiel au développement de la maladie dans le cadre des FHL. Par ailleurs, nous montrons que la cytotoxicité des cellules NK semble normale chez les patients atteints de SoJIA, ce qui suggère que les mécanismes immunologiques à l'origine de la HLH dans les FHL et dans les maladies autoinflammatoires comme la SoJIA sont distincts. Dans la seconde partie de ce manuscrit, nous avons étudié sur le rôle de la sérine/thréonine/tyrosine kinase Styk1 dans la régulation des lymphocytes cytotoxiques NK. Ces derniers sont responsables du contrôle immunitaire précoce des pathogènes intracellulaires et contribuent à l'immunosurveillance des cellules tumorales. Suite à leur activation, ils relâchent de très grandes quantités d'IFN-y et de TNF-α, faisant ainsi le lien entre l'immunité innée et adaptative. La reconnaissance des cellules cibles par les lymphocytes NK est gouvernée par l'expression d'un éventail de récepteurs qui transduisent des signaux, activateurs ou inhibiteurs, et dont la balance se traduit par l'activation ou la tolérance. Ces récepteurs sont codés au sein de deux complexes génétiques très denses, le complexe de cytotoxicité naturelle (NCR) et le complexe des récepteurs des leucocytes (LRC). Au moment de commencer ces travaux, nous avions révélé que l'expression de la kinase Styk1 fait partie de la signature transcriptionnelle des lymphocytes NK. Sa fonction dans le système immunitaire demeure toutefois inconnue. Néanmoins, la localisation génétique favorable de Styk1, près du NCR, ainsi que son implication dans la voie PI3K-AKT, en faisaient un candidat potentiel de régulation des lymphocytes NK. Afin de connaître le rôle de Styk1 dans le développement et les fonctions effectrices des lymphocytes NK, nous avons donc généré une souris pour laquelle Styk1 est invalidé. Nos résultats confirment que Styk1 est exprimée de façon spécifique par les cellules NK. Nous avons également détecté une diminution de l'activité constitutive de la voie AKT/mTOR dans les cellules NK, mais le développement, l'homéostasie et la fonction des cellules NK sont cependant normaux dans les souris déficientes en Styk1 / Upon recognition of infected or target cells, CD8+ T and Natural Killer (NK) lymphocytes initiate a polarized degranulation of vesicle storing cytotoxic molecules (perforin: PRF1 and granzyme B). By altering the target cell’s cellular membrane integrity, perforine allows granzyme B to translocate to its cytosol. Genetic anomalies may affect normal cytotoxic functions and severely hamper the control of intracellular pathogens. In this context, the pathogenic signal remains uninterrupted and both cytotoxic lymphocytes and macrophages are continuously stimulated. This auto-inflammatory pathological condition is named hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) and is fatal without therapeutic intervention. HLH can also occur secondary to infection with viruses from the herpesviridae family, or be concomitant to important immune alterations such as systemic onset juvenile idiopathic arthritis (SoJIA), with no clear etiological cause identified. In 2014, a case of HLH mediated by the constitutive activation of the NLRC4 inflammasome receptor was first described. The inflammasome is a multimeric structure involving a cytosolic receptor, a scaffold protein – ASC – and Caspase-1. In the immune system, the inflammasome is expressed in macrophages and dendritic cells and senses pathogenic (PAMP) and danger (DAMP) associated signals. Once activated, inflammasome’s protein Caspase-1 catalyzes the maturation of pro-IL-1b and pro-IL-18 and leads to their secretion. Since NLRC4 constitutive activation appears to be sufficient for triggering HLH, we aimed to understand if the inflammasome structure was essential to the development of the syndrome. In order to address this question, we invalidated the inflammasome through the abrogation of ASC or Caspase-1 in PRF1 -/- HLH mouse model. We also tested the hypothesis that an altered cytotoxic function could explain the high prevalence of HLH in the proinflammatory context of SoJIA. The results we present here show that the inflammasome is responsible for the elevated levels of IL-18 in the serum of HLH patients. However, the inflammasome is facultative for its development. We also demonstrate that in patients suffering from SoJIA, NK cells show normal cytotoxicity, suggesting that immunological mechanisms involved in FHL and secondary HLH are distinct. In the second part of this manuscript, we aim at understanding the role of Styk1 serine/threonine/tyrosine kinase in NK cells’ regulation. NK cells are in charge of eliminating stressed, virally infected or transformed cells. Upon activation, they secrete large amounts of IFN-γ and TNF-α, thus bridging innate and adaptive immunity. Capabilities for recognition of target cells is endowed by the expression of numerous stochastically expressed activating and inhibitory receptors. The balance between activating and inhibitory signal allows for self-tolerance or activation upon engagement of abnormal cells. Activating and inhibitory receptor are germline encoded in two dense, large complexes, the Natural Killer Complex (NKC) and the Leukocyte Receptor Complex (LRC). At the moment of starting this work, we had recently identified that Styk1 was a signature transcript of NK cells. However, its function in NK cells and more generally in the immune system remains unknown. Nevertheless, its genetic localisation near the NKC and its potential implication in the PI3K-AKT pathway prompt that it may play a role in NK cell development and/or functions. In order to evaluate the role of Styk1 in NK cells’ regulation, we generated a mouse model in which its expression is abrogated. Our data confirms that amongst all immune subsets, Styk1 is specifically expressed by NK cells. Styk1 was also able to discriminate NK cells from other ILCs. In this study, we show that Styk1 invalidation lead to a decrease of activity in the AKT/mTOR pathway. However, NK cells development, homeostasis and function were surprisingly normal in Styk1 -/- mice