Le but visé par la présente recherche est de faire la synthèse d'inhibiteurs de la glutaminyl (GlnRS), de la glutamyl (GluRS) et de l'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS). Le design des inhibiteurs est basé sur l'intermédiaire de la réaction catalysée par les aaRSs, l'adénylate d'aminoacyle. Cet anhydride mixte (carboxylique-phosphorique), hautement instable, est plus fortement lié à l'enzyme que ne le sont ses trois substrats: l'acide aminé, l'ARNt et l'ATP. Différents analogues stables de cet intermédiaire ont été synthétisés dans le but d'empêcher la substitution de l'AMP de l'adénylate d'aminoacyle par l'ARNt. Ainsi, des adénylates d'aminoalkyles, des aminoacylsulfamoyladénosines et des aminoacylphosphonates adénosines ont été synthétisés. Ces composés ont permis d'inhiber l'enzyme correspondante avec des K\ variant du micromolaire au nanomolaire. Ces inhibiteurs ont été utilisés dans des études de cinétiques enzymatiques, en cristallisation et dans la compréhension du mécanisme catalytique de ces enzymes. Les travaux en cours portent sur la rigidification de même que sur la diminution de la polarité de l'adénylate de glutamyle et ce, par la modification de la portion acide glutamique des inhibiteurs déjà synthétisés. La résistance aux antibiotiques constitue un problème très grave de nos jours. Le développement d'antibiotiques possédant de nouveaux modes d'action est au coeur des préoccupations actuelles. Les aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs) sont des enzymes impliquées dans la biosynthèse des protéines. Elles catalysent l'estérification d'un acide aminé sur l'acide ribonucléique de transfert (ARNt). Leur inhibition entraîne, par conséquent, l'arrêt de la croissance cellulaire. Les enzymes humaines ont connu une évolution suffisamment divergente des aaRSs bactériennes rendant ainsi possible l'inhibition sélective de ces dernières. Elles représentent donc des cibles intéressantes pour le développement d'antibiotiques. L'acide pseudomonique, un inhibiteur de l'isoleucyl-ARNt synthétase, possède des propriétés antibiotiques. Il est commercialisé comme antibiotique topique par la compagnie pharmaceutique GlaxoSmithKline.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les Oligosaccharides soluble (OS) sont essentiellement générés durant le processus de dégradation des N-glycoprotéines nouvellement synthétisées et mal conformées (ERAD) et durant la voie « turn-over » des glycoprotéines matures. Dans le but de déterminer si la modification post-traductionnelle O-GlcNAc est effectivement impliquée dans le processus de dégradation des N-glycoprotéines, nous avons analysé par spectrométrie de masse les OS provenant des cellules CHO après traitement par l’inhibiteur PUGNAc. Le PUGNAc ou « O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbanate » est un inhibiteur puissant de l’O-GlcNAcase (OGA) qui catalyse l’hydrolyse du résidu O-GlcNAc des résidus sérine et thréonine des protéines O-GlcNAcylées.L’analyse par spectrométrie de masse révèle l’apparition d’une population d’OS de structures anormaux dans les cellules CHO suite au traitement par le PUGNAc. Cette population a été identifiée comme ayant des structures possédant des résidus GlcNAc au niveau de leur extrémité non-réductrice issues d’une dégradation lysosomale incomplète des glycoprotéines. Contrairement au PUGNAc, le NButGT, un autre inhibiteur de l’OGA, n’aboutit pas à l’apparition de cette population. Ainsi, Nous avons démontré que ces structures s’accumulent exclusivement dans la fraction membranaire conséquence de l’inhibition des β-hexosaminidases lysosomaux par le PUGNAc. Notre étude avait permis, d’un part, de mettre en évidence la capacité du PUGNAc de mimer une maladie de surcharge lysosomale et, d’autre part, de montrer un autre aspect des effets indésirables induits par le PUGNAc et qui nécessite d’être pris en considération lors de l’utilisation de cet inhibiteur. / Free oligosaccharides (fOS) are generated as a result of glycoproteins catabolism that occurs in two principal distinct pathways: the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) of misfolded newly synthesized N-glycoproteins and the mature N-glycoproteins turnover pathway. We analyzed fOS by Mass spectrometry in PUGNAc CHO treated cells in order to investigate whether O-GlcNAc modified proteins were involved in N-glycoprotein degradation process. The O-(2-acetamido-2-deoxy-D-glucopyranosylidene) amino-N-phenylcarbanate (PUGNAc) is a potent inhibitor of the O-GlcNAcase (OGA) catalyzing the cleavage of β-O-linked 2-acetamido-2-deoxy-beta-D-glucopyranoside (O-GlcNAc) from serine and threonine residues of post-translationally modified proteins. Mass spectrometry (MS) analysis revealed the appearance of an unusual population of fOS after PUGNAc treatment. The structures representing this population have been identified as containing non-reducing end GlcNAc residues resulting from incomplete lysosomal fOS degradation. Only observed after PUGNAc treatment, the NButGt, another OGA inhibitor, did not lead to the appearance of the population. These structures have clearly been shown to accumulate in membrane fractions as the consequence of lysosomal β-hexosaminidases inhibition by PUGNAc. As Lysosomal Storage Disorders (LSD) are characterized by the accumulation of fOS in various tissues, our study evokes that PUGNAc mimics a LSD and shows another off target effects that needs to be taken into account in the use of this drug.

Étude de la Sous-Classe B3 et des Inhibiteurs des Métallo β-Lactamases En raison de l'introduction dagents antibactériens, les bactéries ont développé divers moyens de résistance. Le plus commun, déjà fortement développé, est la production denzymes qui hydrolysent la forme la plus largement répandue d'agent antibactérien, les antibiotiques à noyau β-lactame (Frère 1995). Ces enzymes, appelées β-lactamases, ont deux origines. Les β-lactamases à sérine correspondant aux classe A, C et D auraient évolué à partir dune DD-transpeptidase ancestrale, alors que les métallo β-lactamases (MBLs), nont pour linstant aucun ancêtre connu (Ambler 1980) (Matagne et al. 1999). Les MBLs sont importantes médicalement, puisqu'elles peuvent hydrolyser la plupart des β-lactames, y compris les carbapénèmes, qui échappent à l'activité des enzymes à sérine les plus actives (Rasmussen et al. 1997). Un transfert des MBLs entre espèce est également envisageable, du fait que certains gènes codant pour ces enzymes sont présents sur des plasmides (Osano et al. 1994) (Laraki et al. 1999). Les inhibiteurs classiques des β-lactamases à sérine active ont peu ou pas d'effet sur les MBLs et dans certains cas ils peuvent même être hydrolysés par les MBLs. Les MBLs sont produites, comme les β-lactamases à sérine, dans le périplasme des bactéries Gram-négatives ou sont sécrétées par les bactéries Gram-positives, cependant elles ont un mode d'action différent. À la différence des β-lactamases à sérine qui emploient une sérine dans leur site actif pour hydrolyser le noyau β-lactame, les MBLs utilisent lion zinc (Bush et al. 1995). Puisque ces enzymes ne présentent pas le même besoin en ions zinc pour faire preuve dune activité maximale, un débat continuel est mené afin de savoir si les MBLs utilisent un ou deux ions zinc dans leur site actif in vivo. Les MBLs forment un groupe hétérogène qui a été divisé en sous-groupes B1, B2 et B3 par similitude de séquence et spécificité de substrat (Galleni et al. 2001) (Garau et al. 2004). C'est l'hétérogénéité de cette classe qui a rendu la recherche d'un inhibiteur générique difficile. Divers inhibiteurs de MBLs ont été décrits; ceux-ci incluent le captopril, un inhibiteur compétitif des MBLs qui sest avéré efficace contre les enzymes mono-zinc BcII et CphA (Heinz et al. 2003). L'acide thiomandelique s'est avéré un inhibiteur à large spectre pour le composé racémique, avec des valeurs de Ki en-dessous de 1 µM, pour toutes les enzymes testées des sous-classes B1 et B3; bien qu'il ait été inefficace sur CphA du sous-groupe B2 (Mollard et al. 2001). Les hydrazones de sulfonyle inhibent IMP-1, le plus bas Ki étant de 0.7 µM, mais ont un effet limité sur d'autres enzymes B1 telles que BcII (Siemann et al. 2002). Les acides succiniques substitués inhibent également IMP-1 montrant des valeurs dIC50 impressionnantes mais aucune valeur de Ki nest donnée (Toney et al. 2001). L'incubation de CphA avec les β-lactames, moxalactame et céfoxitine, cause l'inactivation de l'enzyme par les produits de la réaction, mais ces inactivateurs sont des substrats pour les enzymes des sous-classes B1 et B3 (Zervosen et al. 2001). La recherche dinhibiteurs s'est tout naturellement concentrée sur les variants IMP et VIM, qui sont des MBLs portées par un plasmide; pour linstant, aucun inhibiteur identifié nest efficace sur tous les sous-groupes (Jin et al. 2004) (Kurosaki et al. 2005) (Siemann et al. 2002). La première partie de cette étude s'est concentrée sur lidentification de molécules modèles potentiellement inhibitrices de MBLs pouvant être développées en inhibiteurs à large spectre des MBLs. Par le criblage nous avons identifié trois modèles différents susceptibles de donner des inhibiteurs efficaces; lun deux est capable de chélater l'espèce mono-zinc, lacide 2,4 pyridine dicarboxylique; un autre est spécifique de FEZ-1, le N,3-Dihydroxy-5-(4-hydroxybenzoyl) benzamide et le dernier est efficace contre toutes les MBLs testées, lacide [(3-Mercaptopropanoyl)amino](phenyl) propanoic. Les résultats obtenus montrent des constantes dinhibition allant du micromolaire au nanaomolaire. La sous-classe B3 contient la MBL L1, dont le spectre daction est le plus large. Cette enzyme peut hydrolyser un éventail de substrats tel que les pénicillines, les céphalosporines et les carbapénèmes (Crowder et al. 1998). Elle partage le repliement αβ/βα et le site di-zinc des autres MBLs mais cest un tétramère, une caractéristique unique parmi les β-lactamases (Saino et al. 1982) (Bicknell et al. 1985). La forme tétramerique de L1 la rend plus difficile à étudier par des techniques telles que la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire ou la spectrométrie de masse. Par conséquent, pour la deuxième partie de cette étude, nous avons décidé d'étudier L1, visant à trouver les conditions dans lesquelles l'enzyme était présente comme monomère, sans besoin de mutation. Les résultats que nous avons obtenus étaient imprévus et nous ont menés à examiner une méthode de production d'apo-enzyme pour les MBLs. L'enzyme a pu facilement être dénaturée et le zinc être enlevé. L'activité a été trouvée après renaturation suite à l'addition de zinc. Cette étude pourrait être poursuivie à l'avenir, les résultats préliminaires obtenus ici sont peu concluants, mais présentent un intérêt cinétique ainsi quun bénéfice à l'étude des MBLs commencée dans ce travail. Le nombre de MBLs connues augmente constamment et la caractérisation de chaque enzyme doit être accomplie pour gagner une pleine compréhension des β-lactamases, afin quil reste un espoir d'empêcher la diffusion supplémentaire de la résistance bactérienne. Pour cette raison le but de la troisième partie de cette étude était de caractériser plus profondément la MBL, GOB-1 de Chryseobacterium meningosepticum. L'analyse de sa séquence en acides aminés, par Bellais et al. 2000 place GOB-1 dans la sous-classe B3 en dépit de son unique résidu liant le zinc Gln116. Nous avons produit GOB-1 en utilisant un vecteur d'expression basé sur le système dexpression du phage T7 et avons purifié l'enzyme. Des mutants de GOB-1 ont été créés par mutagénèse dirigée du résidu liant le zinc Gln116. Une étude cinétique détaillée a alors été réalisée en présence et absence de zinc additionnel montrant que GOB-1 est une enzyme très efficace, capable dhydrolyser efficacement tous les β-lactames testés. Les mutants du résidu Gln116 de GOB-1, produits par mutagénèse dirigée ont montré une perte d'activité qui ne peut pas être corrigée par addition de zinc, démontrant ainsi que GOB-1 n'est pas une enzyme hybride des sous-classes B2 et B3, comme cela avait été précédemment suggéré (Garau et al. 2004), mais plutôt une enzyme nouvelle et améliorée de la sous-classe B3, utilisant les dispositifs structuraux précédemment utilisés par les enzymes de la sous-classe B2 mais en améliorant l'effet.

L’infection par HIV-1 représente un des problèmes de santé publique majeurs de notre société actuelle. Le traitement HAART (Highly Active AntiRetroviral Therapy) inhibe le cycle réplicatif viral mais ne permet pas l’éradication du HIV-1. La principale cause de cet échec thérapeutique est la persistance de réservoirs cellulaires infectés de manière latente par HIV-1, qui, lors de l’arrêt du traitement HAART, sont à l’origine d’un rebond de la charge plasmatique virale. Le défi actuel est donc de découvrir de nouvelles méthodes d’élimination des cellules réservoirs. Une des stratégies envisagées est de forcer l’expression virale dans les cellules infectées de manière latente afin d’entraîner leur destruction suite à leur détection par le système immunitaire ou suite aux effets cytopathiques viraux. Parallèlement, le traitement HAART serait maintenu afin de limiter la propagation des virions néo-synthétisés. Plusieurs éléments sont impliqués dans la répression transcriptionnelle associée à la latence post-intégrationnelle du virus HIV-1 : la nature du site d’intégration ; l’absence de facteurs cellulaires inductibles tels que NF-κB ; la structure chromatinienne du provirus et les modifications post-traductionnelles des histones ; l’absence de niveaux suffisants de la protéine trans-activatrice Tat. De plus, notre laboratoire a précédemment mis en évidence un lien entre deux de ces éléments, en démontrant, dans une lignée modèle de latence post-intégrationnelle, que la cytokine pro-inflammatoire TNFα, un activateur de la voie de signalisation NF-κB, permet une réactivation synergique de l’expression virale combinée à l’inhibiteur d’histone-désacétylases (HDACI) TSA. Cependant, l’utilisation thérapeutique du TNFα et de la TSA est inenvisageable en raison de leurs toxicités. Au cours de notre thèse, nous avons montré que la prostratine, un ester de phorbol non-tumorigène qui active la cascade NF-κB, combinée à des HDACIs déjà utilisés en thérapie humaine, réactive en synergie l’expression virale dans des cellules modèles de latence post-intégrationnelle (U1, J-Lat 8.4 et 15.4). Nous avons également constaté que des cellules dont l’expression virale n’est pas réactivée par un traitement individuel (prostratine ou HDACIs) peuvent être réactivées par la combinaison prostratine+HDACI. Au niveau moléculaire, nous avons montré que le VPA intensifie la cascade NF-κB induite par la prostratine, et permet, combiné à cette dernière, un remodelage plus efficace du nucléosome répresseur nuc-1 et une activation synergique de la transcription. Nous avons testé les combinaisons prostratine+HDACIs sur des cultures ex vivo de PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells) provenant de patients HIV-1+ avirémiques et traités par la HAART. Les combinaisons prostratine+HDACIs réactivent l’expression virale de 25/42 cultures de PBMCs testées avec une réactivation synergique dans 17/25 cas. De plus, la combinaison prostratine+SAHA réactive l’expression virale de 7/9 cultures testées de lymphocytes T CD4+ HLA DR-. Cette étude suggère que des traitements combinant deux types différents d’activateurs de l’expression du HIV-1 pourraient être utilisés comme adjuvant de la thérapie HAART afin d’accélérer la purge des réservoirs cellulaires infectés de manière latente.

Reproduction de : Thèse doctorat : Chimie bioorganique : Reims : 2004. / Titre provenant de l'écran titre. Bibliogr. : 129 réf.

Thèse de doctorat : Sciences de la vie et de la santé : Tours : 2008. / Titre provenant de l'écran-titre.

La voie Hippo, découverte chez la Drosophile et conservée chez les mammifères, a été identifiée comme un élément essentiel dans le contrôle de la taille des organes. Cette cascade de kinases régule la phosphorylation de l’effecteur terminal YAP (ou de son paralogue TAZ), un coactivateur transcriptionnel reconnu comme oncogène. Sa fonction est médiée par sa translocation nucléaire et son interaction avec les facteurs de transcription TEAD, pour former le complexe YAP-TEAD qui active l’expression des gènes cibles responsable de la prolifération cellulaire et de la croissance des organes. La surexpression des protéines YAP/TAZ/TEAD dans de nombreux cancers perturbe l’équilibre de la voie Hippo et favorise la formation du complexe protéique causant une hyperprolifération et la propagation des cellules cancéreuses. Inhiber cette interaction protéine-protéine est une cible thérapeutique prometteuse pour concevoir de nouveaux anticancéreux. Dans cette optique, le laboratoire a considéré deux stratégies. La première consiste à cibler la protéine YAP en synthétisant des dipyrrines, représentant des fragments de la Vertéporfine dans le but de définir le motif minimal requis pour conserver l’activité biologique. Une seconde approche implique la synthèse de ligands de TEAD capable de se positionner au sein de l’interface 3. Basée sur des études de modélisation moléculaire, une famille avec un noyau central triazolique a été optimisée pour établir des relations structure-activité. Les molécules synthétisées sont actuellement en cours d’évaluation, grâce à la mise au point des tests biologiques et physicochimiques, et les premiers résultats ont permis d’identifier un composé prometteur. / The Hippo pathway, firstly described in Drosophila and highly conserved in mammals, has been demonstrated to play a crucial role in the organ size control. This kinase cascade regulates the phosphorylation of the downstream effector YAP (or its paralogue TAZ), a transcriptional coactivator with oncogenic activity. Its function is mediated by its nuclear translocation and interaction with the transcriptional factor TEAD, to form YAP-TEAD complex which activates the genes expression in charge of cell proliferation triggering organ growth. Overexpression of YAP/TAZ/TEAD protein in several cancers disrupts the Hippo pathway balance and urges on YAP-TEAD complex formation causing excessive proliferation and cancer development. Inhibiting this protein-protein interaction is thus a promising therapeutic target for the design of new anti-cancer drugs. In this goal, the laboratory has considered two strategies. The first one consists in targeting the YAP protein by synthesizing dipyrrins, representing Verteporfin fragments to define the minimal requirement yielding the expected biological activity. A second approach involves synthesizing TEAD ligands able to fit in specific interface 3. Based on molecular modeling, a triazole scaffold family was optimized to establish structure-activity relationship. Thanks to the biological and binding tests development, synthesized molecules evaluation is still in progress and the present first results have already allowed identifying a promising compound.

La découverte et le développement d'un médicament est un processus long et très coûteux. Pour améliorer ce processus, une nouvelle approche de criblage et de conception rationnelle de nouveaux ligands est apparue durant la dernière décennie. Elle se base sur le criblage par des techniques de biophysique structurale, de petites molécules organiques appelées "fragments". Ces fragments sont caractérisés par une faible affinité pour la cible mais par une grande efficacité de liaison. Cette approche a été mise en place au CBS et appliquée à la découverte de nouveaux inhibiteurs des cyclophilines humaines. Les cyclophilines (Cyps) sont des protéines ubiquitaires chez l'Homme. Elles possèdent une activité peptidyl-prolyl cis-trans isomèrase et aident au repliement des protéines. Il a été montré que le développement d'inhibiteurs de ces protéines pourrait déboucher sur de nouveaux traitements pour des pathologies telles que le VIH, le VHC, certains cancers ou Alzheimer. Nous avons découvert, par un criblage RMN puis une validation par cristallographie aux rayons X, 14 fragments-touches millimolaires sur les Cyps. Ces fragments-touches ont permis de déterminer une nouvelle famille chimique d'inhibiteurs des Cyps. Le meilleur inhibiteur possède une activité 1-10 µM sur CypA, B et D, et de la dizaine de micromolaires sur la réplication du VHC dans les cellules. Un brevet a été déposé sur cette famille chimique. / Drug discovery and development is a long and expensive process. To improve this process, a new approach of creening and rational drug design appeared during the last decade. This approach is based on screening of small organic compounds called "fragments" by structural biophysic techniques. These fragments are characterized by low affinity for the target but high ligand efficiency. This approach was implemented at the CBS and applied to find new human cyclophilin inhibitors. Cyclophilins (Cyps) are ubiquitous proteins in Human. They have a peptidyl-prolyl cis-transisomerase activity and help protein folding. It was shown that development of inhibitors for these proteins could lead to new treatments against HIV, HCV, cancers or Alzheimer diseases for example. We discovered 14 fragment hits in the millimolar range on the Cyps by NMR screening and further validation by X-ray crystallography. With these fragment hits, we identified a new family of chemical inhibitors of the Cyps. The best inhibitor has 1-10 µM activity on CypA, B and D, and around 10 micromolar activity on HCV replication in cells. A patent has been deposited for this family of chemical inhibitors.

Grâce à des propriétés physico-chimiques particulières, le fluor prend de plus en plus d’importance dans la chimie médicinale et plus particulièrement dans les peptidomimétiques. Dans ce mémoire, deux classes de peptidomimétiques fluorées ont été étudiées.Dans la première partie, de nouveaux groupements N-Rf ; les hydrazines difluoro ou trifluorométhylées et les 1,2,3 triazoles N-difluorométhylés ont été préparés et des études de leurs propriétés structurales ont montré l’intérêt de l’incorporation du fluor sur la conformation des pseudopeptides via des interactions NH-F.Dans la seconde partie, de nouveaux peptidomimétiques comportant des groupements cyclopropanes trifluorométhylés ont été conçus et synthétisés en tant qu’inhibiteurs potentiels du protéasome 26S (un macro-complexe protéique impliqué dans la dégradation de nombreuses protéines intracellulaires et qui a fait ses preuves en tant que cible pour le traitement de cancers). / Through special physico-chemical properties, fluorine is becoming increasingly important in medicinal chemistry and particularly in peptidomimetics. In this paper, two classes of fluorinated peptidomimetics were studied.In the first part, new N-Rf moieties; difluoro or trifluoromethylated hydrazines and N-difluoromethyl 1,2,3 triazoles were prepared and the study of their structural properties have shown the benefit of the incorporation of fluorine on the conformation of the peptidomimetics via NH-F interactions.In the second part, new trifluoromethylated cyclopropanes containing peptidomimetics were designed and synthesized as potential inhibitors of the 26S proteasome, a macro-complex protein involved in the degradation of many intracellular proteins and which has been recognized as a target for cancer treatment.