Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2010. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-06-13T18:45:48Z No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-20T13:38:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_LarissaCostaSouza.pdf: 1921437 bytes, checksum: 95665a015ade6f8fd6913fc4218169c1 (MD5) / Dietas ricas em leguminosas têm sido associadas à baixa incidência de câncer em populações humanas, sendo essas plantas, ricas em inibidores de proteases. O BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) é um inibidor de protease da família Bowman-Birk, isolado de sementes da leguminosa Vigna unguiculata (feijão-de-corda), que inibe a tripsina e a quimotripsina simultaneamente. Diversos estudos mostraram o efeito de um Inibidor Bowman-Birk (BBI) no controle de vários tipos de câncer. Recentemente, o BTCI foi caracterizado como um agente anticarcinogênico em estudos in vitro utilizando células de câncer de mama. Os resultados encontrados nesse estudo apontam para efeitos citotóxicos e citostáticos, no entanto, o mecanismo molecular envolvido nesses eventos ainda não foi elucidado. Considerando que o câncer está, de forma geral, relacionado a disfunções no ciclo celular, a via ubiquitina-proteassoma torna-se alvo promissor para o controle de células cancerosas. A investigação dos efeitos do BTCI no proteassoma é uma das principais metas que nortearam o presente trabalho. A caracterização físico-química e molecular da associação BTCI-proteassoma é fundamental para a compreensão da atividade do BTCI, relacionada ao controle do ciclo celular de células de câncer de mama, visando à possível aplicação desse inibidor como agente anticarcinogênico. O BTCI apresentou inibição contra as três atividades proteolíticas do proteassoma 20S: quimotripsina, tripsina e caspase-like. Adicionalmente, peptídeos derivados do BTCI, com apenas um sítio de inibição, apresentaram inibição do proteassoma com menor afinidade, ou ativação de algumas atividades proteolíticas desse complexo macromolecular. O BTCI e o proteassoma 20S formaram complexos estáveis em temperaturas até 55ºC e em pHs neutros e básicos, sendo esse complexo sensível ao NaCl. Estudos in vitro mostraram que o BTCI é colocalizado com o proteassoma em células de câncer de mama MCF-7 no citoplasma e no núcleo e não altera a ubiquitinação de proteínas nessas células. O peptídeo derivado de BTCI, Pep1, que inibe o sítio da quimotripsina, não afeta o conteúdo de proteínas ubiquitinadas nas células MCF-7, o que pode estar relacionado com a inibição de proteínas E3 ligase, envolvidas na ubiquitinação de proteínas celulares. Esses dados indicam que a via ubiquitina-proteassoma está relacionada aos efeitos anticarcinogênicos do inibidor BTCI em células de câncer de mama, MCF-7, o que justifica a ampliação dos estudos nessa linha de pesquisa, visando à aplicação biotecnológica desse inibidor na terapia contra o câncer de mama. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Diets rich in leguminous, a rich source of protease inhibitors, have been associated with low incidence of cancer in humans. The BTCI (black-eyed pea trypsin/chymotrypsin inhibitor) is a Bowman-Birk protease inhibitor isolated from Vigna unguiculata (black-eyed pea) seeds, which inhibits trypsin and chymotrypsin simultaneously. Several studies have shown the effect of a Bowman-Birk inhibitor (BBI) in various types of cancer. Recently, BTCI was characterized as an anticancer agent in studies in vitro using breast cancer cells. The results from this study show cytotoxic and cytostatic effects of BTCI, however, the molecular mechanism involved in these events has not yet been elucidated. Considering that cancer is, in general, related to dysfunction in the cell cycle, the ubiquitin-proteasome pathway becomes a promising target for cancer cells control. The investigation of the BTCI effects on proteasome is one of the main purposes of the present study. The physical-chemical and molecular characterization of the BTCI-proteasome association is essential for understanding the activity of BTCI, related to cell cycle control in breast cancer cells, in order to consider its pharmacological application as anticarcinogenic agent. BTCI showed inhibition against all three proteolytic activities of 20S proteasome: chymotrypsin, trypsin and caspase-like. Additionally, peptides derived from BTCI, with only one inhibition site, showed proteasome inhibition with lower affinity or activation of some proteolytic activities of this macromolecular complex. The BTCI and the 20S proteasome formed stable complexes at temperatures up to 55°C and neutral and alkaline pHs, however, this complex is sensitive to NaCl. In vitro studies showed that BTCI colocalizes with the proteasome in breast cancer cells, MCF-7, at cytoplasm and nucleus, and does not alter the ubiquitination of proteins in these cells. The peptide derived from BTCI, Pep1, which inhibits the chymotrypsin site, does not affect the ubiquitinated proteins content in MCF-7 cells, which may be related to inhibition of E3 ligase protein, involved in the ubiquitination of cellular proteins. These data indicate that the ubiquitin-proteasome pathway is related to the anticarcinogenic effects of BTCI in breast cancer cells MCF-7, which justifies the further studies in the same research line, aimed the biotechnological application of this inhibitor in therapy against breast cancer.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-01-21T12:31:26Z No. of bitstreams: 1 2015_GabrielAlvaresBorges.pdf: 2129782 bytes, checksum: f55a7d0acbab0d72aa21749cdfad222d (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2016-04-06T14:38:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_GabrielAlvaresBorges.pdf: 2129782 bytes, checksum: f55a7d0acbab0d72aa21749cdfad222d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-06T14:38:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_GabrielAlvaresBorges.pdf: 2129782 bytes, checksum: f55a7d0acbab0d72aa21749cdfad222d (MD5) / A via PI3K/AKT/mTOR apresenta-se superativada nos carcinomas escamosos de cabeça e pescoço (HNSCC). O estudo de substâncias que tenham por alvo as proteínas efetoras dessa via é de fundamental importância para o desenvolvimento de terapias para o câncer que sejam mais efetivas, mais específicas e menos deletérias aos pacientes. Com essa justificativa, objetivou-se com esse trabalho a avaliação dos efeitos biológicos dos inibidores de mTOR em linhagens celulares de HNSCC. O tratamento das linhagens SCC-9 (carcinoma de língua), FaDu (carcinoma de hipofaringe) e HaCaT (queratinócitos) com everolimus e temsirolimus, inibidores rapanálogos, e ainda com curcumina, resveratrol e EGCG, inibidores derivados da dieta, em diversas concentrações, possibilitou o estabelecimento de uma curva dose-resposta para cada substância em cada linhagem. A partir das curvas, foram calculados valores de IC50, com os quais os experimentos subsequentes foram realizados. O índice de seletividade tumoral foi calculado, e a curcumina e o everolimus mostraram-se seletivos para as linhagens SCC-9 e FaDu em relação à célula HaCaT. Em associação à radioterapia, os inibidores demonstraram efeito sinérgico significativo na linhagem FaDu (p<0,05), o que não foi observado na célula HaCaT, indicando também seletividade para a linhagem neoplásica. O everolimus causou inibição da migração celular das linhagens FaDu e HaCat a partir de 24h (p<0,05). O everolimus ainda induziu apoptose na célula SCC-9 (p<0,05) e interrompeu o ciclo celular das linhagens SCC-9 e FaDu na fase S (p<0,05). Um perfil de morte celular incerto de apoptose tardia ou necrose foi observado nas células SCC-9 e FaDu tratadas com temsirolimus (p<0,05). A curcumina causou interrupção do ciclo celular na fase G2/M nas linhagens SCC-9 e FaDu (p<0,05). Observou-se ainda a inibição da expressão da proteína p-mTOR pelo teste de western blot na linhagem FaDu tratada com curcumina. Tais resultados instigam novos estudos que aprofundem o conhecimento sobre a ação e mecanismos dos inibidores de mTOR, viabilizando sua aplicação clínica. / The PI3K/AKT/mTOR signalling pathway is overactivated in head and neck cancers, and the study of substances which target effector proteins of this pathway is important for the development of therapeutic options that are more effective and specific and less deleterious to the patient. With such justification, this study had as objective evaluating the effects of mTOR inhibitors in head and neck cancer cell lines. By treating SCC-9 (tongue carcinoma), FaDu (hypopharynx carcinoma) and HaCaT (oral keratinocytes) cell lines with Everolimus and Temsirolimus, both rapalogs, and Curcumin, Resveratrol and EGCG, diet-derived inhibitors, in different concentrations, it was possible to establish dose-response curves for each substance with each cell line. IC50 values were obtained and used for subsequent experiments. A tumour selectivity index was calculated, and curcumin and everolimus were found to be selective to SCC-9 and FaDu cell lines. When combined with radiotherapy, all inhibitors demonstrated a significant synergic effect on FaDu cell line (p<0.05), which was not observed on HaCaT and indicates the combination as selective to neoplastic cells. Everolimus cause cell migration inhibition in FaDu and HaCat from 24h of treatment on (p<0.05), resulted in apoptosis in SCC-9 (p<0.05) and arrested cell cycle in S-Phase in SCC-9 and FaDu cells (p<0.05). A doubtful cell death profile of late apoptosis or necrosis was observed in SCC-9 and FaDu cells treated with temsirolimus (p<0.05). Curcumin caused a cell cycle arrest in G2/M in both SCC-9 and FaDu cells (p<0.05) and inhibited p-mTOR expression, as observed in the western blot assay performed with FaDu cells. Such results instigate new studies that help construct the knowledge on the action and mechanisms of the mTOR inhibitors and make their clinical application feasible and more comprehensive.