Techn. Universiẗat, Diss., 2006--Darmstadt.

The work deals with the synthesis and characterization of cerulenin analogues as inhibitors of efflux pump mediated resistance of Candida albicans isolates and as inhibitors of the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis. Cerulenin was chosen as the lead structure, being a substrate of the efflux pumps in Candida albicans on one hand and therefore variations on the structure could lead to a blocking of the efflux pumps as in the case of tetracycline and inhibitor 13-CPTC of the TetB efflux pump. On the other hand, cerulenin is a known inhibitor of the FAS system but inhibition is unselective in type I and II FAS. Therefore, analogues could result in increased selectivity towards the type II FAS system in M. tuberculosis. The first cerulenin derivatives were prepared by coupling 2,3-dihydrofuran to the before synthesized 1-octaniodide, followed by ring opening and oxidation in one step by chromic acid and transfer of the resulting 4-keto acid to amides to give analogues 4a-d, 4e was prepared in analogy. To include the epoxide function especially with regard to the mechanism of action of cerulenin in the FAS system (considering known crystal structures of cerulenin and the KasA analogue of E. coli) tetrahydro- and dihydrocerulenin analogues were synthesized. Starting from the corresponding aldehyde, lactone 5 (tetrahydrocerulenin analogues) was obtained via two different routes A and B. Route A included the coupling of the aldehyde 1-nonanal to propiolic acid via a Grignard reaction with subsequent hydrogenation with the Lindlar catalyst under hydrogen pressure to give 5. Via Route B 1-nonanal was coupled to methyl propiolate by n-BuLi with subsequent hydrogenation under reflux with the catalytic system Lindlar cat./NH4HCO2 to yield 5. These hydrogenations were also executed in a microwave oven resulting in better yields and/or reaction times. The lactone 5 was then epoxidized, the ring opened by amidation and the remaining alcohol was oxidized via Collins oxidation to result in tetrahydrocerulenin analogues 8a-e. The same procedure was used for dihydrocerulenin analogues 10a-c except that to obtain the corresponding lactone 9a only route A was used and a further step had to be executed for ring closure. To obtain analogues with all structural features of cerulenin including two double bonds and the epoxide function, a third pathway was chosen. To obtain the future side chain, aldehyde 12 was synthesized by coupling protected 4-pentyn-1-ol to either crotyl bromide or crotyl chloride, which then was deprotected, hydrogenated with Lindlar catalyst under hydrogen pressure and oxidized via a Swern oxidation. The following synthesis sequence starting from 12 was executed similar to that of dihydrocerulenins via the corresponding lactone (51) with the major exception of the oxidation procedure in the last step via TPAP/NMO to result in (4Z,7E)-cerulenin analogues 15a-b. A fourth class of cerulenin analogues was synthesized with the aromatic analogues 17a-e. This synthesis pathway started with the formation of the benzoyl acrylamides 16a-e from benzoylacrylic acid via a mixed anhydride which was prepared with isobutylchloroformate followed by the addition of the corresponding amine. Subsequent epoxidation with H2O2 in basic EtOH gave the aromatic cerulenin analogues 17a-e. Pharmacological testings for the synthesized substances were executed on efflux pump-resistant and -sensitive Candida albicans isolates, on the fatty acid synthesis enzyme KasA of Mycobacterium tuberculosis and on other organisms such as Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa within the Sonderforschungsbereich 630. / Die Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung von Ceruleninanaloga als Inhibitoren effluxpumpenresistenter Candida-albicans-Isolate und als Inhibitoren des Fettsäuresyntheseenzyms KasA von Mycobacterium tuberculosis. Der Naturstoff Cerulenin wurde als Leitstruktur gewählt, da er einerseits ein Substrat der bekannten Effluxpumpen von Candida albicans ist und deshalb Strukturvariationen zu einer Blockierung der Effluxpumpen, wie im Fall von Tetrazyklin und dem Inhibitor 13-CPTC der TetB Effluxpumpe, führen können. Andererseits ist Cerulenin ein bekannter Inhibitor der Fettsäuresynthese, allerdings unselektiv für Typ I und II. Ceruleninanaloga als Fettsäureinhibitoren könnten daher eine erhöhte Selektivität bezüglich des Typ II Fettsäuresystems in M. tuberculosis aufweisen. Die in dieser Arbeit zuerst synthetisierten Ceruleninderivate wurden durch Kupplung von 2,3-Dihydrofuran und dem zuvor dargestellten 1-Octaniodid gefolgt von Ringöffnung und Oxidation mittels Chromsäure zur 4-Ketosäure, und Umsetzung zum entsprechenden Amid und somit den Ceruleninanaloga 4a-d hergestellt. Substanz 4e wurde entsprechend synthetisiert. Um die Epoxidfunktion der Leitstruktur zu integrieren, die besonders hinsichtlich des Wirkmechanismus von Cerulenin im FAS-System wichtig zu sein scheint (wenn man die bekannten Kristallstrukturen von Cerulenin und dem KasA-Analogon in E. coli berücksichtigt), wurden Tetrahydro- und Dihydroceruleninanaloga synthetisiert. Ausgehend von dem entsprechendem Aldehyd wurde (im Fall der Tetrahydrocerulenine) Lacton 5 auf zwei verschiedene Arten dargestellt: mittels Route A und B. Route A beinhaltete die Kupplung des Aldehyds 1-Nonanal mit Propiolsäure durch eine entsprechende Grignardreaktion mit anschließender Hydrierung über Lindlar-Katalysator unter Wasserstoffdruck. Bei Route B wurden 1-Nonanal und Methylpropiolat mittels n-BuLi gekuppelt und anschließend hydriert durch Refluxieren mit Lindlar-Katalysator und NH4HCO2. Die Hydrierungen von Route A und B wurden auch in der Mikrowelle durchgeführt, wodurch bessere Ausbeuten und/oder Reaktionszeiten erzielt werden konnten. Das so dargestellte Lacton 5 wurde dann epoxidiert, der Lactonring durch den Angriff eines Amins geöffnet und der so entstandene Alkohol mittels Collins Oxidierung zu den Tetrahydroceruleninanaloga 8a-e oxidiert. Dihydroceruleninanaloga 10a-c wurden auf analogem Syntheseweg hergestellt mit dem Unterschied, dass die entsprechende Lactonzwischenstufe 9a nur durch Route A synthetisiert und ein weiterer Zwischenschritt zum Ringschluss benötigt wurde. Um Ceruleninanaloga mit allen strukturellen Komponenten des Cerulenins inklusive zweier Doppelbindungen und Epoxidfunktion zu erhalten, wurde ein dritter Syntheseweg gewählt. Zur Integration der späteren Seitenkette wurde zuerst Aldehyd 12 durch Kupplung von geschütztem 4-Pentyn-1-ol mit entweder Crotylbromid oder Crotylchlorid, anschließendem Entschützen und Hydrierung über Lindlar-Katalysator und unter Wasserstoffdruck und nachfolgender Swern Oxidation synthetisiert. Die anschließende Synthesesequenz startete von Substanz 12 und wurde in Anlehnung der Synthese an die Dihydroceruleninderivate über Lacton 51 durchgeführt. Die größte Abweichung stellte dabei die Oxidation im letzten Schritt dar, die mittels TPAP/NMO durchgeführt wurde und in den (4Z,7E)-Ceruleninanaloga 15a-b resultierte. Eine vierte Klasse von Ceruleninanaloga wurde mit den aromatischen Derivaten 17a-e synthetisiert. Diese Route startete mit der Synthese der Benzoylacrylamide 16a-e aus Benzoylacrylsäure über das gemischte Anhydrid, das mit Isobutylchloroformiat hergestellt wurde, gefolgt von der Zugabe des entsprechenden Amins. Die nachfolgende Epoxidierung mit H2O2 in basischem EtOH ergab die aromatischen Ceruleninanaloga 17a-e. Pharmakologische Testungen der synthetisierten Substanzen wurden an Efflux-pumpen-resistenten und -sensitiven Candida albicans Isolaten, am Fettsäuresyntheseenzym KasA von Mycobacterium tuberculosis und an anderen Mikroorganismen wie Leishmania major, Trypanosoma brucei brucei, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa im Sonderforschungsbereich 630 durchgeführt.

Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis. It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards. / Trotz der weltweiten Verbreitung gefälschter Arzneimittel und solcher, die nicht die deklarierte Menge an Wirkstoff enthalten, sind vor allem Entwicklungs- und Schwellenländer von dieser Problematik betroffen. Die Arzneimittelüberwachungs- bzw. Zulassungsbehörden dieser Länder verfügen nur über eingeschränkte Möglichkeiten, die Arzneimittelqualität regelmäßig zu überwachen und somit sicherzustellen, dass die im Markt befindlichen Medikamente eine gute Qualität aufweisen. Einer der Gründe hierfür ist unter anderem, dass die in Arzneibüchern beschriebenen Methoden oftmals sehr komplex sind und eine umfassende Laborausstattung, spezielle Geräte oder teure Chemikalien benötigen. In dieser Arbeit wurden einfache, genaue und robuste flüssigchromatographische Methoden entwickelt, die lediglich günstige, überall verfügbare Chemikalien (z. B. Methanol oder einfache Puffersalze) benötigen und mit denen der Gehalt des deklarierten Arzneistoffes, Arzneistoffverwechslungen sowie das Verunreinigungsprofil bestimmt werden kann. Es konnten drei isokratische, robuste flüssigchromatographische sowie zwei dünnschichtchromatographische Methoden zur Bestimmung von Sulfadoxin, Sulfalen, Pyrimethamin, Primaquin, Artesunat sowie Amodiaquin entwickelt und validiert werden. Alle flüssigchromatographischen Methoden arbeiten isokratisch, folglich können sie auch mit sehr einfachen HPLC-Geräten mit beispielsweise nur einem Pumpenkopf genutzt werden. Zudem werden nur einfache, kommerziell erhältliche C18-Säulen benötigt. Die densitometrischen Methoden für Sulfadoxin/Sulfalen sowie Pyrimethamin benötigen standardisierte Dünnschichtchromatographie-Platten sowie günstige, überall verfügbare und wenig toxische Chemikalien wie beispielsweise Toluol, Methanol oder Ethylacetat. Für die Methode zur Bestimmung von Artesunat und Amodiaquin werden Hochleistungsdünnschichtchromatographie-Platten und Triethylamin sowie Acetonitril benötigt. Dieser Umstand ist der Tatsache geschuldet, dass Amodiaquin und Artesunat sich anderweitig nur ungenügend trennen ließen. Die dünnschichtchromatographischen Protokolle können als Alternative zur HPLC eingesetzt werden, beispielsweise überall dort, wo bereits die entsprechenden Gerätschaften vorhanden sind. Natürlich weisen dünnschichtchromatographische Methoden im Vergleich zur Flüssigchromatographie eine geringere Sensitivität, Präzision und Richtigkeit auf, dies kann jedoch dadurch umgangen werden, die entsprechenden Methoden nur zum Screening zu verwenden und die zu analysierenden Proben anderweitig, z. B. in externen Laboratorien, detailliert zu untersuchen. Dort können beispielsweise Methoden aus gängigen Arzneibüchern verwendet werden. Durch die Implementierung der neu entwickelten Methoden kann zum einen das Problem schlecht verfügbarer Chemikalien umgangen werden und gleichzeitig die Anzahl an untersuchten Arzneimitteln erhöht werden. Dies ist ein wichtiger Beitrag zur Qualitätskontrolle in Ländern mit eingeschränkten Infrastrukturen.

Liquid chromatography has become the gold standard for modern quality control and purity analytics since its establishment in the 1930s. However, some analytical questions remain very challenging even today. Several molecules and impurities do not possess a suitable chromophore for the application of UV detection or cannot be retained well on regular RP columns. Possible solutions are found in derivatization procedures, but they are time consuming and can be prone to errors. In order to detect non chromophore molecules underivatized, the concept of aerosol based universal detection was established with the introduction of the evaporative light scattering detector (ELSD) in the 1970s and the charged aerosol detector (CAD) followed in 2002. These two challenging fields – polar and non chromophore molecules – are tackled in this thesis. An overview of applications of the CAD in the literature and a comparison to its aerosol based competitors and MS is presented, emphasizing on its high sensitivity and robustness. Parameters and techniques to overcome the drawbacks of CAD, such as the use of gradient compensation or adjusted evaporation temperatures are discussed. A consideration of aspects and drawbacks of data transformation such as the integrated power function value (PFV) in the GMP environment is performed. A method for the fatty acid analysis in polysorbate 80 that was developed on HPLC CAD was transferred to UHPLC CAD. Time and eluent savings of over 75% and 40%, respectively, as well as ways to determine the optimal CAD parameters resulted from this investigation. The evaporation temperature was determined as the most crucial setting, which has to be adjusted with care. Optimal signal to noise ratios are found at a compromise between maintaining analyte signal and reducing background noise. The incorporation of semi volatile short chain fatty acids enabled the observation of differences based on volatility of the analyte. E.g. for semi volatiles, an improved linearity by means of adjusting the PFV is achieved at values below 1.0 instead of at elevated PFVs. Using sugars and sugar related antibiotics, a proof-of-concept was given that artificial neural networks can describe correlations between the structure and physicochemical properties of molecules and their response in CAD. Quantitative structure property relationships obtained by design of experiment approaches were able to predict the response of unseen substances and yielded insights on the response generation of the detector, which heavily relies on the formed surface area of the dried particle. Further work can substantiate upon these findings, eventually building a library of diverse eluent compositions, analytes and settings. In order to cope with a chromatographically challenging substances, the application of ion pairing reversed phase chromatography coupled to low wavelength UV detection has been shown as a possible approach for the amino acid L asparagine. A method capable of compendial purity analysis in one single HPLC approach, thus making the utilization of the semi quantitative TLC-ninhydrin analysis obsolete, resulted from this. One cyclic dipeptide impurity (diketoasparagine) that was formerly not assessed, could be identified in several batches and added to the monograph of the Ph.Eur. Studying ibandronate sodium with CAD and ELSD, it was found that randomly occurring spike peaks represent a major flaw of the ELSD when high sample load is present. The research with this non chromophore bisphosphonate drug furthermore shed light on possible drawbacks of mixed mode chromatography methods and ways to overcome these issues. Due to strong adsorption of the analyte onto the column, over ten injections of the highly concentrated test solution were found to be necessary to ensure reproducible peak areas. Preconditioning steps should thus be evaluated for mixed mode approaches during method development and validation. Last, using a ternary mixed mode stationary phase coupled to CAD, a method for the impurity profiling of pamidronate disodium, also applicable to the assessment of phosphate and phosphite in four other bisphosphonate drugs, has been developed. This represents a major advantage over the Ph.Eur. impurity profiling of pamidronate, which requires two different methods, one of which is only a semi quantitative TLC approach. / Flüssigchromatographische Untersuchungen sind seit deren Einführung in den 1930er Jahren zum Goldstandard für die moderne Qualitätskontrolle und Reinheitsanalytik geworden. Allerdings sind auch noch heutzutage einige Fragestellungen sehr herausfordernd. Viele Moleküle und Verunreinigungen besitzen keinen geeigneten Chromophor, das die Anwendung klassischer UV Detektion ermöglicht, oder erfahren auf gewöhnlichen Umkehrphasen keine ausreichende Retention. Lösungsansätze in Form von Derivatisierungsverfahren sind zeitaufwändig und fehleranfällig. Um underivatisierte Moleküle ohne geeignetes Chromophor zu analysieren, wurde das Prinzip der auf Aerosolen basierenden universellen Detektion mit dem „Evaporative Light Scattering Detector (ELSD)“ in den 1970er Jahren entwickelt und 2002 folgte der „Charged Aerosol Detector (CAD)“. Diese zwei Felder - polare und nicht chromophore Analyte - werden in der vorliegenden Dissertation bearbeitet. Eine Literaturübersicht und analyse von Applikationen des CAD, sowie ein Vergleich zu seinen auf Aerosoltechnik basierenden Konkurrenten und der Massenspektroskopie wird dargestellt; besonders die hohe Sensitivität und Robustheit werden ersichtlich. Geräteeinstellungen und Techniken, mit denen sich Nachteile des CAD ausgleichen lassen, werden erläutert und diskutiert. Hierbei werden beispielsweise die Gradientenkompensation oder die Veränderung der Verdampfungstemperatur diskutiert. Ein Überblick über Möglichkeiten und Nachteile der Datentransformation des CAD Signals mittels des eingebauten „Power Function Values (PFV)“ im GMP Umfeld wird gegeben. Ein Methodentransfer der Analytik von Fettsäuren in Polysorbat 80 von HPLC CAD zu UHPLC CAD wurde durchgeführt. Chemikalien und Zeitersparnisse jenseits von 40 bzw. 75%, sowie Herangehensweisen für die Optimierung der CAD Einstellungen resultierten hieraus. Die Verdampfungstemperatur ist der wichtigste Parameter des Detektors und sollte stets feinjustiert werden. Die höchste Sensitivität findet sich für einen Kompromiss aus verringertem Rauschen und auch erhaltenem Analytsignal. Durch die Analyse von semi flüchtigen Fettsäuren konnten Unterschiede, die auf der Flüchtigkeit von Substanzen basieren, erarbeitet werden. Für semi flüchtige Stoffe ist die Linearisierung mittels PFV bespielsweise bei Werten unter 1.0 erfolgreich, wohingegen für nicht flüchtige Analyte Werte jenseits von 1.0 optimal sind. Für Zucker und zuckerverwandte Antibiotika konnte ein konzeptioneller Beweis erbracht werden, dass künstliche neuronale Netzwerke Korrelationen zwischen den physikochemischen Eigenschaften der Moleküle und deren Signal im CAD herstellen können. Ein solches Netzwerk wurde mittels Methoden des experimentellen Designs erstellt. Die CAD Detektorantwort, die stark von der Oberfläche der Partikel abhängt, konnte auf diese Weise für Substanzen innerhalb des Experimentalraumes vorhergesagt werden. Hierauf aufbauend kann eine Bibliothek aus Analyten, Fließmitteln und Detektorparametern erarbeitet werden, um weiteres Detailwissen über den CAD zu erhalten. Die Aminosäure L Asparagin stellt eine chromatographische Herausforderung dar. Es wurde eine Ionenpaar Umkehrphasen Methode mit UV Detektion bei 210 nm als erfolgreicher Ansatz gezeigt. Die arzneibuchkonforme Bestimmung des Verunreinigungsprofils ist mit dieser Methode in einem Lauf möglich, wodurch die Nutzung der halbquantitativen Dünnschichtchromatographie obsolet wird. Weiterhin konnte ein cyclisches Dipeptid (Diketoasparagin), welches zuvor nicht im Verunreinigungsprofil gelistet war, in einigen Batches gefunden und so der Monographie des Ph.Eur. hinzugefügt werden. Bei der Untersuchung von Natrium-Ibandronat mit dem CAD und dem ELSD konnte gezeigt werden, dass zufällig auftretende „spike peaks“ bei hohen Probenkonzentrationen ein enormes analytisches Problem des ELSD darstellen. Weiterhin wurde mit der Analyse der nicht chromophoren Bisphosphonaten ein Problem von „mixed mode“ Chromatographie aufgedeckt. Durch die starke Adsorption des Analyten auf der Säule waren über zehn Injektionen der konzentrierten Testlösung notwendig, um reproduzierbare Peakflächen zu erhalten. Derartige Sättigungs- und Vorkonditionierungsprozesse sollten für „mixed mode“ Chromatographie während der Entwicklung und Validierung untersucht werden. Zuletzt wurde eine ternäre „mixed mode“ stationäre Phase gekoppelt mit CAD verwendet, um das Verunreinigungsprofil von Pamidronat Dinatrium zu analysieren. Diese entwickelte Methode konnte auch für die Bestimmung von Phosphat und Phosphit in vier anderen Bisphosphonaten genutzt werden. Erneut ergibt sich ein Vorteil gegenüber der Arzneibuchmethode für Pamidronat, welche zwei verschiedene Methoden - eine davon nur eine halbquantitative Dünnschichtchromatographie - nutzt.

The charged aerosol detector (CAD) is an aerosol-based detector employed in liquid chromatography which has become established in the field of pharmaceutical analysis due to its outstanding performance characteristics, e.g. the almost uniform response for nonvolatile analytes. Owing to its principle of detection, the response of the CAD depends on the volatility of a compound and is inherently nonlinear. However, the newly implemented instrumental settings evaporation temperature and power function value (PFV) are valuable tools to overcome some of these drawbacks and can even enhance the detector’s capabilities when adjusted properly. This thesis aimed to evaluate the impact of the new instrumental settings on the CAD performance. Additionally, the influence of modern separation techniques for small polar compounds on the CAD was assessed and the applicability of hyphenated UV-CAD techniques explored. The optimization strategies derived from the evaluation procedures and the conjunction of the instrumental and chromatographic techniques investigated were utilized for the challenging impurity profiling of amino acids and amino acid-like drugs. The results of the method validation procedures confirmed the broad applicability of the CAD in the pharmaceutical analysis of nonvolatile compounds, supported by satisfactory sensitivity and reproducibility for meeting the regulatory requirements with respect to the ICH guidelines Q2(R1) and Q3A(R2). The limits of applicability include the analysis of semivolatile compounds, and the method transfer between current and legacy CAD models. Further advances in the definition and standardization of allowed ranges for the instrumental settings and the establishment of general optimization procedures in the method development could lead to a more widespread use of the detection technique in compendial methods. / Der “charged aerosol detectorˮ (CAD) ist ein aerosol-basierter Detektor in der Flüssigchromatographie, der sich im Bereich der pharmazeutischen Analytik etabliert hat, da er über herausragende Leistungsmerkmale verfügt, wie das annährend einheitliche Signal für nichtflüchtige Analyte. Aufgrund des Detektionsprinzips ist das Signal des Detektors abhängig von der Flüchtigkeit einer Verbindung und zudem nichtlinear. Die neu eingeführten Geräteparameter Verdampfungstemperatur und „power function value” (PFV) stellen hierbei wertvolle Werkzeuge dar, um einige der mit dem Detektionsprinzip verbundenen Nachteile auszugleichen und können darüber hinaus die Detektionsmöglichkeiten erweitern, sofern sie auf geeignete Weise eingestellt wurden. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Auswirkungen der neuen Geräteparameter auf die Leistungsfähigkeit des Detektors zu untersuchen. Zusätzlich wurde der Einfluss moderner Trenntechniken auf den CAD beurteilt und die Anwendbarkeit gekoppelter UV-CAD Techniken erforscht. Die sich aus den Evaluierungsprozeduren ergebenden Optimierungsstrategien und die Verknüpfung der untersuchten instrumentellen und chromatographischen Techniken wurden anschließend verwendet, um Methoden für die herausfordernde Verunreinigungsanalyse von Aminosäuren und Arzneistoffen mit Aminosäurestruktur zu entwickeln. Die Ergebnisse der Validierungsverfahren bestätigten die weitgehende Anwendbarkeit des CAD in der pharmazeutischen Analyse nichtflüchtiger Verbindungen, unterstützt durch zufriedenstellende Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit, wodurch die Vorgaben der ICH-Leitfäden Q2(R1) und Q3A(R2) erfüllt werden konnten. Einschränkungen der Anwendbarkeit bestehen in der Analyse halbflüchtiger Verbindungen, sowie im Methodentransfer zwischen gegenwärtigen und alten CAD-Modellen. Weitere Fortschritte in der Definition und Standardisierung erlaubter Bereiche für die Einstellung der Geräteparameter und die Etablierung allgemeiner Optimierungsverfahren in der Methodenentwicklung könnten zu einer umfassenderen Nutzung der Detektionstechnik für Arzneibuchmethoden führen.

Unsere Lebensmittel haben eine zweifache, auch vom Gesetz vorgegebene Zweckbestimmung, d.h. sie dienen einerseits dem Genuss und andererseits der Ernährung. Aktuelle For-schungsstrategien in der Lebensmittelchemie auf diesen Gebieten lassen sich dahingehend zusammenfassen, dass im ersten Bereich die Suche nach wirksamen Aromastoffen und deren Vorläufern sowie auch zunehmend Probleme der Herkunftsanalytik im Vordergrund stehen. Auf dem Gebiet der Ernährung spiegeln die Schlagworte „Funktionalität“ und „Bioaktivität“ die derzeitigen Entwicklungen wider. Für alle Bereiche bilden instrumentell-analytische Techniken die Grundlage für Bewertungen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit haben wir daher das uns zur Verfügung stehende analytische Potential genutzt, in den oben genannten Gebieten einschlägige Beiträge zu leisten, d.h. die Suche nach wertgebenden Aromastoffen fortzuführen, Zuckerkonjugate zu untersuchen, die sowohl als Aromavorläufer als auch im Hinblick auf Bioaktivitätsstudien von Bedeutung sein können, und schließlich Methoden zur Herkunftsanalytik zu forcieren. Zu diesen Studien sind als attraktive und wirtschaftlich be-deutsame Rohwaren Rucola (Eruca sativa Mill.) und Kaffee (Coffea arabica) eingesetzt worden. Mit Hilfe der Kopplung aus S-selektiver Detektion und strukturselektiver massen-spektro-metrischer Analytik sind in Extrakten von Rucolablättern 22 schwefelhaltige Verbindungen strukturell charakterisiert worden. Darunter befanden sich neben Minorkomponenten wie 3-Sulfanyl-1-hexanol, Glucosinolatabbauprodukte wie 4-Methylthiobutylnitril, 4-Methylthiobutylthiocyanat und 4-Methylthiobutylisothiocyanat. Mit [1,3]-Thiazepan-2-thion ist eine bislang nicht bekannte Komponente erstmals beschrieben wor-den. Das Vorkommen von 3-Sulfanyl-1-hexanol, welches im Übrigen anhand von MDGC-MS-Analytik in nahezu racemischer Form (44:56 Prozent, R:S) in Rucola gefunden wurde, forderte dazu heraus, in einer Modellstudie eine allgemeine Methode zur Bestimmung der Absolutkonfiguration azyklischer 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole mittels der ECCD-Methode zu entwickeln. Dabei wurden in einer Ein-Schritt-Synthese die funktionellen Grup-pen der 2- und 3-Sulfanyl-1-alkanole (in der Studie handelte es sich um enantiomerenreine 2- und 3-Sulfanyl-1-hexanole) jeweils mit dem Chromophor 9-Anthroylflourid derivatisiert. Die ent-sprechenden CD-Splitkurven erlaubten eine eindeutige Zuordnung der Konfiguration. Die entwickelte Mikro-Maßstab-Methode wurde ebenfalls er-folgreich zur Bestimmung der Absolutkonfiguration von in der Studie als zusätzliche Modellverbindungen eingesetzten 1,2- und 1,3-Diolen angewendet. 3-Sulfanyl-1-hexanol wurde abschließend in einer Zwei-Schritt-Synthese mit 9- und 2-Anthroylflourid derivatisiert, auch diese Variation erlaubte eine eindeutige Zuordnung der Absolutkonfiguration. Mittels präparativer HPLC-Techniken wurden drei neue Flavonoidglykoside aus Rucolablättern isoliert. Deren Charakterisierung erfolgte mittels Tandemmassenspektrometrie sowie ein- und zweidimensionalen NMR-Messungen. Die Verbindungen sind als Quercetin-3,3’,4’-tri-O-beta-D-glucopyranosid, Quercetin-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-pyranosid und Quercetin-3-(2-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyranosyl)-3’-(6-sina-poyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-sid identifiziert worden. Diese Quercetin-Derivate zeigten sowohl hinsichtlich der Glucosilierung des Aglykons (an den Positionen 3, 3’ und 4’) als auch bezüglich der Acylierung ungewöhnliche Strukturen. Bei Rohkaffee hat man bislang keine Studien über das Vorkommen von Zuckerkonjugaten als Aromastoffvorläufer durchgeführt. Wir konnten diese Lücke anhand der Strukturaufklärung der nachfolgend aufgeführten Verbindungen schließen. Durch Kombination verschiedener präparativer Techniken (CCC, LC und HPLC) mit verschiedenen Methoden der Strukturaufklärung (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, ein- und zweidimensionale NMR) sind aus Rohkaffee fünf Aromastoffprekursoren isoliert und identifiziert worden. Für die beiden aus Rohkaffee isolierten Linalyldisaccharide wurden als Strukturen 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-glucopyranosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranosid (AK1) und 3(S)-Linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyranosyl-(1-6)-beta-D-apiofuranosid ermittelt. Weiterhin sind erstmals drei neue Aromastoffprekursoren in Form von Zuckerestern, d.h. (3-Methylbutanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranosid, (3-Methylbuta-noyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructofuranosid und (3-Methyl-2-butenoyl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanosid in Rohkaffee charakterisiert worden. Die Kenntnis der Herkunft bestimmter Lebensmittel bzw. einzelner In-haltstoffe spielt für die Lebensmittelindustrie eine wichtige Rolle. Für die Zuordnung der geographischen Herkunft von Rohkaffee wurden in dieser Arbeit die 13C/12C-, 2H-/1H- und 18O/16O-Verhältnisse von extrahiertem Coffein mittels Elementaranalysator-Isotopen-massen-spektro-metrie (EA-IRMS) bestimmt. Zur Bewertung der Multielement-Messwerte wurden diese statistischen Berechnungen unterzogen. Zur Anwendung kamen die Lineare Diskrimi-nanzanalyse (LDA) und die Auswertung mittels sog. „Classification and Regression Trees“ (CART). In der Anpassung wurde dabei eine Probe aus der Klasse 1 (Provenienz Afrika) der Klasse 2 (Provenienz Amerika) zugeordnet und eine Probe der Klasse 2 der Klasse 1 zugeordnet (Fehlerrate von 5,1 Prozent). Bei Kreuzvalidierung wurden drei der 39 Proben falsch zugeordnet (jeweils zwei der Klasse 1 und eine der Klasse 2), die Fehlerrate betrug hier somit 7,7 Prozent. Die Proben der Klasse 3 (synthetisches Coffein) ließen sich zu 100 Prozent von denjenigen natürlichen Ursprungs unterscheiden. / Our foods exhibit two functions defined by legislation, too, i.e. to provide pleasure and nutri-tive effects. Current research strategies in food chemistry in these areas can be summarized as follows, i.e. that in the first-mentioned area the search for effective aroma substances and their precursors as well as, increasingly, also problems of authenticity assessments predominate. In the area of nutrition, the highlights “functionality” and “bioactivity” reflect the actual research trends. In all areas instrumental-analytical techniques form the fundament of evaluations. Thus, we used our analytical potential to provide new informations in the above-mentioned areas, i.e. to continue the search for valuable aroma compounds, to study sugar conjugates being important as flavour precursors and for bioactivity studies, as well as, finally, to strengthen methods for authenticity assessment. For these studies rocket salad (Eruca sativa Mill.) and green coffee (Arabica coffea), both known as attractive industrially important raw materials, were used. In flavour extracts of rocket salad leaves we characterized 22 sulphur-containing constituents by means of HRGC-MS/SCD analysis. This analytical tool allows parallel detection of com-pounds eluting from the GC column by mass spectrometry (to get structural information) and by chemiluminescence (to get selectively signals of sulphur-containing substances). Among the identified constituents we detected minor compounds such as 3-sulfanyl-1-hexanol, by-products of myrosinase hydrolysis such as 4-methylthiobutyl nitrile, 4-methylthio-butyl thiocyanate and 4-methylthiobutyl isothiocyanate as well as [1,3]-thiazepan-2-thion, the latter described for the first time. By means of multidimensional GC-MS (MDGC-MS) the enantiomeric ratio of 3-sulfanyl hexanol was determined as 44 per cent (R) to 56 per cent (S). In addition, a method for the determination of the absolute configuration of chiral 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols (and 1,2 diols and 1,3 diols as model compounds) was developed. We demonstrated for the first time that the CD exciton chirality method can be extended to acyclic 2- and 3-sulfanyl-1-alkanols. The simple one-step derivatization using the 9-anthroate chromophore provided a general microscale method for the determination of the absolute configuration. Exciton coupling between the two 9-anthroate chromophores led to intense positive split CD curves for the (R)-configured 2-sulfanyl-1-alkanols and the (S)-configured 3-sulfanyl-1-alkanols as well as vice versa. The developed method was also useful for the stereochemical assignment of 1,2- and 1,3-diols. Furthermore, the application of the two step-derivatization using two different chromophores for both functional groups (2- and 9-anthroate) also resulted in mirror image split CD curves for both enantiomers, allowing the stereochemical assignment of 3-sulfanyl-1-alkanols. Three novel flavonoid glycosides were isolated of leaves of rocket salad by means of preparative techniques. Structural elucidation was performed using LC-MS/MS as well as one and two dimensional NMR experiments. The compounds were identified as quercetin 3’,4’-tri-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side, quercetin 3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-3,4’-di-O-beta-D-gluco-py-ra-no-side and quercetin 3-(2-sinapoyl-O-beta-D-glucopyranosyl)-3’-(6-sinapoyl-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl)-4’-O-beta-D-gluco-py-rano-side. These quercetin derivatives exhibited unusual structures as to the glucosylation of the aglycones (at positions 3, 3’ and 4’) and the type of acylation. Studies of bound flavour precursors in green coffee beans (Coffea arabica) have not been carried out to date. We were able to fill out this gap by means of structural analysis of the following compounds. By combination of different preparative analytical steps (CCC, LC and HPLC) with several analytical methods of structural elucidation (HRGC-MS, HPLC-MS/MS, one and two dimensional NMR experiments) five flavour precursors were isolated and identi-fied in green coffee beans. The two isolated linalool disaccharides were identified as 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-py-ra-nosyl-(1-6)-alpha-L-arabinofuranoside and 3(S)-linalyl-3-O-beta-D-gluco-pyra-no-syl-(1-6)-beta-D-apiofuranoside. In addition, three novel flavour precursors were identified as sugar esters, i.e. (3-methyl-butanoyl)-1-O-beta-D-glucopyranosyl-beta-D-apiofuranoside, (3-methylbutanoyl)-6-O-alpha-D-gluco-pyranosyl-(1-2)-beta-D-fructo-furano-side and (3-Methyl-2-buteno-yl)-O-beta-D-gluco-pyranosyl-beta-D-apio-furanoside. The knowledge of the origin of food and its ingredients is actually one of the major topics for the food industry. For the assignment of the geographic origin of green coffee we determined the ratios of 13C/12C, 2H/1H and 18O/16O of extracted caffeine by means of elemental analysator/isotopic mass spectrometry (EA-IRMS). To check the suitability of the analytical data obtained by EA-IRMS we used statistical calculations, i.e. (i) linear discrimination analysis (LDA) and (ii) validation via classification and regression trees (CART). In the course of adap-tion one sample of class 1 (origin Africa) was assigned to class 2 (origin middle and south America) and vice versa, resulting in an error rate of 5.1 per cent. Using cross validation three of the 39 analyzed samples were assigned incorrectly resulting in an error rate of 7.7 per cent. Samples of class 3 (synthetic caffeine) were discriminated from that of natural origin at a rate of 100 per cent.

Spectroscopic methods were established decades ago in a wide variety of fields. This also applies to the pharmaceutical field, although they initially were mostly used for identity testing or structure elucidation only. Technical developments, such as miniaturization (NMR benchtop devices), Fourier transformations (for NMR, MIR spectroscopy) or the combination with chemometric evaluation (e.g., in Process Analytical Technology, PAT), have further increased their importance and opened up new applications. The aim of this work was to investigate further new approaches and to find new applications for already established methods and to show their benefits. By means of MIR, NIR and NMR data and their chemometric evaluation (principal component analysis, PCA; hierarchical cluster analysis, HCA; linear discriminant analysis, LDA), possibilities were presented to successfully determine the manufacturer or the pharmaceutical company of various paracetamol preparations. In the course of this, various similarities and correlations between the preparations of individual companies could also be identified. For this purpose, a suitable sample preparation was developed for each spectroscopic method, and suitable measurement parameters in order to obtain reproducible spectra for the chemometric evaluation were determined. Furthermore, the results of the two unsupervised methods (HCA, PCA) were compared with each other. The HCA was able to confirm those of the PCA for the very most part. Additionally, through these methods it was possible to characterize many of the preparations based on clusters formed by comparable tablet compositions. In order to be able to measure unmortared, whole tablets using the NIR spectrometer, an attachment was developed and manufactured using 3D printing. Its functionality was demonstrated by measuring and analyzing the tablets of two different batches of nine paracetamol preparations. The batches were clearly distinguished on the basis of a PCA and a significant difference was also demonstrated by means of statistical tests. For NMR spectroscopy, a method was developed to obtain optimized "fingerprint" spectra of drug formulations. For this purpose, a 1D DOSY measurement was elaborated, in which the signals of the active ingredient could be filtered out by the appropriate choice of measurement parameters. The chemometric evaluation can thus focus on the remaining signals of the excipients, on the basis of which the preparations of the same API can be distinguished. Especially in the case of formulations that consist largely of active ingredient, data pre processing of the spectra can thus be simplified and greater importance can be assigned to the originally very small excipient signals. A quantitative 1H NMR method was developed for the comparison of a high field spectrometer (400 MHz) with a benchtop spectrometer (80 MHz) for two finished drugs. It was shown that it is possible to obtain comparable results with both instruments, but that the influence of the excipients on the signals and the lower resolution of the benchtop instrument must be taken into account. Therefore, it was not possible to obtain comparable results without further optimization of the method for one of the active ingredients. In the investigation of various reactions between APIs and excipients using DOSY, its usefulness as a screening method in stability testing was demonstrated. For this purpose, three different APIs and excipients were stressed together and the reaction mixtures were subsequently measured using DOSY. Based on the translational diffusion coefficient, the reaction products could be identified and distinguished from the active ingredients and the excipients used. The importance of thoughtful processing could also be demonstrated. If all peak heights are selected when evaluating signals split by direct spin spin coupling, this allows the detection of hidden signals as long as not all signals have the same diffusion coefficient. The selective selection of individual peak heights in the case of split signals also enables the evaluation of signals that overlap slightly. However, the limitations of this method were also shown when two signals overlap too much and differ too little in their diffusion coefficients. Hence, it has been successfully demonstrated in the various projects that the new chemometric approaches, as well as the new applications of already established methods, enable in depth findings and thus have a clear added value. / Spektroskopische Methoden haben sich schon vor Jahrzehnten in den verschiedensten Bereichen etabliert. Dies betrifft auch den pharmazeutischen Bereich, auch wenn sie hier zunächst meist nur zur Identitätsprüfung oder Strukturaufklärung verwendet wurden. Durch technische Weiterentwicklungen, wie Miniaturisierungen (NMR benchtop Geräte), Fourier Transformationen (NMR, MIR) oder die Kombination mit einer chemometrischen Auswertung (z. B. bei Process Analytical Technology, PAT), haben sie weiter an Bedeutung gewonnen, und es wurden neue Einsatzbereiche erschlossen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, weitere neue Ansätze zu untersuchen und neue Anwendungen für bereits etablierte Methoden zu finden und deren Mehrwert aufzuzeigen. Es wurden Möglichkeiten aufgezeigt mittels MIR , NIR und NMR Daten und deren chemometrischen Auswertungen (Hauptkomponentenanalyse, PCA; hierarchische Clusteranalyse, HCA; lineare Diskriminanzanalyse, LDA) erfolgreich den Hersteller bzw. das pharmazeutische Unternehmen verschiedener Paracetamol Präparate zu bestimmen. In diesem Zuge konnten Ähnlichkeiten zwischen Präparaten unterschiedlicher Firmen identifiziert werden. Um dies zu erreichen, wurde für jede spektroskopische Methode eine geeignete Probenvorbereitung entwickelt sowie geeignete Messparameter festgelegt, um reproduzierbare Spektren für die chemometrische Auswertung zu erhalten. Weiterhin wurden die Ergebnisse der zwei unüberwachten Methoden (HCA, PCA) miteinander verglichen, wobei die HCA die der PCA zum allergrößten Teil bestätigen konnte. Zudem war es möglich durch diese Methoden viele der Präparate anhand von Clustern zu charakterisieren, die durch vergleichbare Tablettenzusammensetzungen gebildet wurden. Um mit Hilfe des NIR Spektrometers intakte Tabletten vermessen zu können, wurde ein Aufsatz entwickelt und mittels 3D Druck hergestellt. Dessen Funktionalität wurde überprüft, indem Tabletten aus je zwei unterschiedlichen Chargen von neun Paracetamol Präparaten vermessen und analysiert wurden. Dabei konnten die Batches anhand einer PCA eindeutig unterschieden und zudem mittels statistischer Tests ein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden. Für die NMR Spektroskopie wurde eine Methode entwickelt, um optimierte „Fingerprint“ Spektren von Arzneimittelformulierungen zu erhalten. Dazu wurde eine 1D DOSY Messmethode erarbeitet, bei der durch die passende Wahl der Messparameter die Signale des Wirkstoffes herausgefiltert werden konnten. Die chemometrische Auswertung konnte sich somit auf die Signale der Hilfsstoffe beschränken, anhand derer die Präparate unterschieden werden können. Vor allem bei Formulierungen, die zum größten Teil aus Wirkstoff bestehen, kann so eine Datenvorverarbeitung der Spektren vereinfacht und den ursprünglich sehr kleinen Hilfsstoffsignalen eine größere Bedeutung beigemessen werden. Für den Vergleich eines Hochfeld Spektrometers (400 MHz) mit einem „benchtop“ Spektrometer (80 MHz) wurde für zwei Fertigarzneimittel eine quantitative 1H NMR Methode entwickelt. Es konnte gezeigt werden, dass es möglich ist, mit beiden Geräten vergleichbare Ergebnisse zu erzielen. Dabei ist jedoch der Einfluss der Hilfsstoffe auf die Signale sowie die geringere Auflösung des „benchtop“ Gerätes zu berücksichtigen. Aus diesen Gründen war es ohne eine weitere Optimierung der Methode für einen der Wirkstoffe nicht möglich vergleichbare Ergebnisse mit beiden Geräten zu erzielen. Bei der Untersuchung verschiedener Reaktionen zwischen Wirk- und Hilfsstoffen mittels DOSY konnte dessen Nutzen als Screening Methode bei Stabilitätstests gezeigt werden. Für diesen Zweck wurden drei verschiedene Wirk- und Hilfsstoffe gemeinsam gestresst und die Reaktionsgemische anschließend mittels DOSY vermessen. Anhand des translationalen Diffusionskoeffizienten konnten die Reaktionsprodukte identifiziert und von den eingesetzten Wirk- und Hilfsstoffen unterschieden werden. Ebenso konnte die Bedeutung einer sorgfältigen Prozessierung demonstriert werden. Werden bei der Auswertung von Signalen, die durch direkte Spin Spin Kopplung aufgespalten wurden, alle Peakhöhen ausgewählt, erlaubt dies die Detektion von versteckten Signalen, falls nicht alle Signale den gleichen Diffusionskoeffizienten besitzen. Die selektive Auswahl einzelner Peakhöhen bei aufgespaltenen Signalen ermöglicht zudem die Auswertung von leicht überlappenden Signalen. Es wurden jedoch auch die Grenzen dieser Methode aufgezeigt: wenn zwei Signale zu stark überlappen und sich dabei in ihrem Diffusionskoeffizienten zu wenig unterscheiden. Somit konnte in den verschiedenen Projekten erfolgreich gezeigt werden, dass die neuen chemometrischen Ansätze, sowie die neuen Anwendungen bereits etablierter Methoden vertiefte Erkenntnisse ermöglichen und somit einen deutlichen Mehrwert besitzen.