A insuficiência hepática aguda é caracterizada por morte celular maciça de hepatócitos. As primeiras células que se ativam após uma lesão hepática são as células de Kupffer. Estas células secretam citocinas e produzem espécies reativas de oxigénio, causando a apoptose de hepatócitos. Em um estudo anterior, mostramos que plaquetas encapsuladas aumentam a sobrevida de animais em um modelo de insuficiência hepática aguda em 10 dias. Aqui investigamos como as plaquetas exercem o seu efeito benéfico precoce nesse modelo. Para isso, plaquetas encapsuladas ou cápsulas vazias foram implantadas em ratos submetidos a hepatectomia parcial de 90%. Os animais foram eutanasiados 1, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas (n=6/grupo/hora) após hepatectomia. O fígado remanescente foi coletado para avaliar o estresse oxidativo, a atividade da caspase 3 e a expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo ou função hepática. Além disso, os níveis de lipopolissacarideos no soro e no tecido foram medidos. O número de células de Kupffer do fígado remanescente foi avaliado. A interação de plaquetas encapsuladas e células de Kupffer foi investigada utilizando um sistema de co-cultura. Foi observado que os níveis de lipopolissacarideos foram semelhantes em ambos os grupos, assim como a expressão do gene de Tlr4 e Myd88, mas o Lbp foi maior no grupo plaquetas. O número de células de Kupffer no grupo plaquetas estava aumentado 1 hora após hepatectomia, voltando a níveis normais em seguida. No grupo controle estava aumentado às 6 até 72 horas. Além disso, as plaquetas modulam a expressão de interleucina-6 e interleucina-10 em células de Kupffer após 24 horas de co-cultura. Além disso, as plaquetas aumentam a atividade de superóxido dismutase e catalase e reduzem a peroxidação lipídica. Além disso, a atividade da caspase 3 também foi reduzida em animais que receberam plaquetas encapsuladas às 48 e 72 horas. A expressão da óxido nítrico sintase endotelial, do fator nuclear kappa B e interleucina-6 estavam elevados no grupo de plaquetas. A expressão do gene de albumina e do fator V também estavam aumentados no grupo plaquetas. Estes resultados indicam que as plaquetas interagem com as células de Kupffer e exercem o seu efeito benéfico através de redução do estresse oxidativo no fígado o que resulta em hepatócitos saudáveis e diminuição da apoptose. Além disso, estes efeitos são mediados por fatores parácrinos imediatamente após a lesão hepática. / Acute liver failure is characterized by massive hepatocyte cell death. Kupffer cells are the first cells to be activated after liver injury. They secrete cytokines and produce reactive oxygen species, leading to apoptosis of hepatocytes. In a previous study, we showed that encapsulated platelets increase survival in a model of acute liver failure. Here we investigate how platelets exert their early beneficial effect in this model. For that, encapsulated platelets or empty capsules were implanted in rats submitted to 90% partial hepatectomy. Animals were euthanized at 1, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours (n = 6/group/time) after hepatectomy. Liver was collected to assess oxidative stress, caspase activity, and gene expression related to oxidative stress or liver function. Also, lipopolysaccharide (LPS) levels in serum and tissue were assessed. The number of Kupffer cells in the remnant liver was evaluated. Interaction of encapsulated platelets and Kupffer cells was investigated using a co-culture system. It was observed that LPS levels were similar in both groups, as well as gene expression of Tlr4 and Myd88, but Lbp was higher in platelet group. The number of Kupffer cells in platelet group was increased at 1 hour and then returned to normal levels; in control group it was increased from 6 to 72 hours. Platelets modulate Interleukin-6 and Interleukinl-10 expression in Kupffer cells after 24 hours of co-culture. In addition, platelets increase superoxide dismutase and catalase activity and reduce lipid peroxidation. Moreover, caspase 3 activity was also reduced in animals receiving encapsulated platelets at 48 and 72 hours. Gene expression of endothelial nitric oxide synthase, nuclear factor kappa B and Interleukin-6 were elevated in platelet group. Gene expression of albumin and factor V were also increased in platelet group. These results indicate that platelets interact with Kupffer cells in this model and exert their beneficial effect through reduction of oxidative stress that results in healthier hepatocytes and decreased apoptosis. Furthermore, these effects are mediated by paracrine factors immediately after liver injury.

A insuficiência hepática aguda é caracterizada por morte celular maciça de hepatócitos. As primeiras células que se ativam após uma lesão hepática são as células de Kupffer. Estas células secretam citocinas e produzem espécies reativas de oxigénio, causando a apoptose de hepatócitos. Em um estudo anterior, mostramos que plaquetas encapsuladas aumentam a sobrevida de animais em um modelo de insuficiência hepática aguda em 10 dias. Aqui investigamos como as plaquetas exercem o seu efeito benéfico precoce nesse modelo. Para isso, plaquetas encapsuladas ou cápsulas vazias foram implantadas em ratos submetidos a hepatectomia parcial de 90%. Os animais foram eutanasiados 1, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas (n=6/grupo/hora) após hepatectomia. O fígado remanescente foi coletado para avaliar o estresse oxidativo, a atividade da caspase 3 e a expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo ou função hepática. Além disso, os níveis de lipopolissacarideos no soro e no tecido foram medidos. O número de células de Kupffer do fígado remanescente foi avaliado. A interação de plaquetas encapsuladas e células de Kupffer foi investigada utilizando um sistema de co-cultura. Foi observado que os níveis de lipopolissacarideos foram semelhantes em ambos os grupos, assim como a expressão do gene de Tlr4 e Myd88, mas o Lbp foi maior no grupo plaquetas. O número de células de Kupffer no grupo plaquetas estava aumentado 1 hora após hepatectomia, voltando a níveis normais em seguida. No grupo controle estava aumentado às 6 até 72 horas. Além disso, as plaquetas modulam a expressão de interleucina-6 e interleucina-10 em células de Kupffer após 24 horas de co-cultura. Além disso, as plaquetas aumentam a atividade de superóxido dismutase e catalase e reduzem a peroxidação lipídica. Além disso, a atividade da caspase 3 também foi reduzida em animais que receberam plaquetas encapsuladas às 48 e 72 horas. A expressão da óxido nítrico sintase endotelial, do fator nuclear kappa B e interleucina-6 estavam elevados no grupo de plaquetas. A expressão do gene de albumina e do fator V também estavam aumentados no grupo plaquetas. Estes resultados indicam que as plaquetas interagem com as células de Kupffer e exercem o seu efeito benéfico através de redução do estresse oxidativo no fígado o que resulta em hepatócitos saudáveis e diminuição da apoptose. Além disso, estes efeitos são mediados por fatores parácrinos imediatamente após a lesão hepática. / Acute liver failure is characterized by massive hepatocyte cell death. Kupffer cells are the first cells to be activated after liver injury. They secrete cytokines and produce reactive oxygen species, leading to apoptosis of hepatocytes. In a previous study, we showed that encapsulated platelets increase survival in a model of acute liver failure. Here we investigate how platelets exert their early beneficial effect in this model. For that, encapsulated platelets or empty capsules were implanted in rats submitted to 90% partial hepatectomy. Animals were euthanized at 1, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours (n = 6/group/time) after hepatectomy. Liver was collected to assess oxidative stress, caspase activity, and gene expression related to oxidative stress or liver function. Also, lipopolysaccharide (LPS) levels in serum and tissue were assessed. The number of Kupffer cells in the remnant liver was evaluated. Interaction of encapsulated platelets and Kupffer cells was investigated using a co-culture system. It was observed that LPS levels were similar in both groups, as well as gene expression of Tlr4 and Myd88, but Lbp was higher in platelet group. The number of Kupffer cells in platelet group was increased at 1 hour and then returned to normal levels; in control group it was increased from 6 to 72 hours. Platelets modulate Interleukin-6 and Interleukinl-10 expression in Kupffer cells after 24 hours of co-culture. In addition, platelets increase superoxide dismutase and catalase activity and reduce lipid peroxidation. Moreover, caspase 3 activity was also reduced in animals receiving encapsulated platelets at 48 and 72 hours. Gene expression of endothelial nitric oxide synthase, nuclear factor kappa B and Interleukin-6 were elevated in platelet group. Gene expression of albumin and factor V were also increased in platelet group. These results indicate that platelets interact with Kupffer cells in this model and exert their beneficial effect through reduction of oxidative stress that results in healthier hepatocytes and decreased apoptosis. Furthermore, these effects are mediated by paracrine factors immediately after liver injury.

A insuficiência hepática aguda é caracterizada por morte celular maciça de hepatócitos. As primeiras células que se ativam após uma lesão hepática são as células de Kupffer. Estas células secretam citocinas e produzem espécies reativas de oxigénio, causando a apoptose de hepatócitos. Em um estudo anterior, mostramos que plaquetas encapsuladas aumentam a sobrevida de animais em um modelo de insuficiência hepática aguda em 10 dias. Aqui investigamos como as plaquetas exercem o seu efeito benéfico precoce nesse modelo. Para isso, plaquetas encapsuladas ou cápsulas vazias foram implantadas em ratos submetidos a hepatectomia parcial de 90%. Os animais foram eutanasiados 1, 3, 6, 12, 24, 48 e 72 horas (n=6/grupo/hora) após hepatectomia. O fígado remanescente foi coletado para avaliar o estresse oxidativo, a atividade da caspase 3 e a expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo ou função hepática. Além disso, os níveis de lipopolissacarideos no soro e no tecido foram medidos. O número de células de Kupffer do fígado remanescente foi avaliado. A interação de plaquetas encapsuladas e células de Kupffer foi investigada utilizando um sistema de co-cultura. Foi observado que os níveis de lipopolissacarideos foram semelhantes em ambos os grupos, assim como a expressão do gene de Tlr4 e Myd88, mas o Lbp foi maior no grupo plaquetas. O número de células de Kupffer no grupo plaquetas estava aumentado 1 hora após hepatectomia, voltando a níveis normais em seguida. No grupo controle estava aumentado às 6 até 72 horas. Além disso, as plaquetas modulam a expressão de interleucina-6 e interleucina-10 em células de Kupffer após 24 horas de co-cultura. Além disso, as plaquetas aumentam a atividade de superóxido dismutase e catalase e reduzem a peroxidação lipídica. Além disso, a atividade da caspase 3 também foi reduzida em animais que receberam plaquetas encapsuladas às 48 e 72 horas. A expressão da óxido nítrico sintase endotelial, do fator nuclear kappa B e interleucina-6 estavam elevados no grupo de plaquetas. A expressão do gene de albumina e do fator V também estavam aumentados no grupo plaquetas. Estes resultados indicam que as plaquetas interagem com as células de Kupffer e exercem o seu efeito benéfico através de redução do estresse oxidativo no fígado o que resulta em hepatócitos saudáveis e diminuição da apoptose. Além disso, estes efeitos são mediados por fatores parácrinos imediatamente após a lesão hepática. / Acute liver failure is characterized by massive hepatocyte cell death. Kupffer cells are the first cells to be activated after liver injury. They secrete cytokines and produce reactive oxygen species, leading to apoptosis of hepatocytes. In a previous study, we showed that encapsulated platelets increase survival in a model of acute liver failure. Here we investigate how platelets exert their early beneficial effect in this model. For that, encapsulated platelets or empty capsules were implanted in rats submitted to 90% partial hepatectomy. Animals were euthanized at 1, 3, 6, 12, 24, 48 and 72 hours (n = 6/group/time) after hepatectomy. Liver was collected to assess oxidative stress, caspase activity, and gene expression related to oxidative stress or liver function. Also, lipopolysaccharide (LPS) levels in serum and tissue were assessed. The number of Kupffer cells in the remnant liver was evaluated. Interaction of encapsulated platelets and Kupffer cells was investigated using a co-culture system. It was observed that LPS levels were similar in both groups, as well as gene expression of Tlr4 and Myd88, but Lbp was higher in platelet group. The number of Kupffer cells in platelet group was increased at 1 hour and then returned to normal levels; in control group it was increased from 6 to 72 hours. Platelets modulate Interleukin-6 and Interleukinl-10 expression in Kupffer cells after 24 hours of co-culture. In addition, platelets increase superoxide dismutase and catalase activity and reduce lipid peroxidation. Moreover, caspase 3 activity was also reduced in animals receiving encapsulated platelets at 48 and 72 hours. Gene expression of endothelial nitric oxide synthase, nuclear factor kappa B and Interleukin-6 were elevated in platelet group. Gene expression of albumin and factor V were also increased in platelet group. These results indicate that platelets interact with Kupffer cells in this model and exert their beneficial effect through reduction of oxidative stress that results in healthier hepatocytes and decreased apoptosis. Furthermore, these effects are mediated by paracrine factors immediately after liver injury.

A insuficiência hepática aguda é resultante da perda das funções vitais do fígado em consequência da disfunção maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos parácrinos da terapia com células em microcápsulas semipermeáveis, em modelos de insuficiência hepática aguda. Em uma primeira etapa animais submetidos a hepatectomia parcial de 90% foram transplantados com células da medula óssea (CMO) encapsuladas ou cápsulas vazias. Os resultados demonstraram um aumento na sobrevida em 10 dias nos animais tratados com CMO encapsuladas. Estudos em tempos iniciais da regeneração (em até 72 horas) demonstraram que as CMO reduziram a expressão de genes que favorecem a regeneração hepática e aumentaram a expressão de reguladores negativos da regeneração. Como consequência, houve uma diminuição da taxa de regeneração nos animais tratados. Este efeito ocorreu através de mecanismos parácrinos. Na segunda etapa avaliamos a capacidade de diferenciação das células da fração mononuclear da medula óssea (CFMMO) encapsuladas in vivo e in vitro. Animais submetidos a uma lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4) foram transplantados com CFMMO encapsuladas. Animais sem lesão hepática foram utilizados como controle. Observou-se que, 48 horas após o transplante as CFMMO passaram a expressar genes característicos de hepatócitos. A fim de estudar melhor os mecanismos envolvidos nesta diferenciação, utilizamos CFMM encapsuladas em um modelo in vitro que replicasse as características do modelo in vivo. Assim empregamos um sistema de co-cultivo, onde as CFMMO encapsuladas eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos com ou sem lesão por CCl4. Nossos resultados demonstraram que em apenas 6 horas de co-cultivo in vitro as CFMMO encapsuladas expressaram marcadores hepáticos. Estes resultados sugerem a ocorrência de diferenciação das CFMMO em tempos muito precoces por mecanismos parácrinos. Em conjunto, os resultados apresentados nos permitem concluir que a microencapsulação celular se mostrou uma ferramenta adequada para avaliar os processos que ocorrem na lesão hepática aguda de maneira bidirecional. Sendo assim, pudemos observar o efeito que as células da medula óssea (total ou fração mononuclear) exercem sobre o tecido hepático lesado, bem como o efeito que substâncias secretadas por este tecido têm sobre essas células. / Acute liver failure results from loss of the liver’s vital functions due to major dysfunction of hepatic tissue. In several cases, liver transplantation is the definitive treatment, despite the liver’s regenerative capacity. Regeneration mechanisms involve intricate regulatory pathways, with activation of growth factors and cytokines. Cell therapy with bone marrow stem cells has been proposed as a therapeutic alternative. However, its use remains in the experimental field. The objective of this study was to investigate paracrine effects of cell therapy in models of acute liver failure with the use semipermeable microcapsules. First, animals undergoing 90% partial hepatectomy were transplanted with encapsulated bone marrow cells (BMC) or empty capsules. Results showed an increase in 10-day survival in treated animals treated with encapsulated BMC. Studies performed at earlier steps (within 72 hours) demonstrated that BMC reduced expression of genes that promote liver regeneration and increased the expression of its negative regulators. As a consequence, there was a decrease in the rate of liver regeneration in treated animals, and this effect occurred through paracrine mechanisms. In the second study we evaluated the differentiation ability of encapsulated bone marrow mononuclear cells (BMMC) in vivo and in vitro. Animals submitted to carbon tetrachloride (CCl4) induced acute liver injury were transplanted with encapsulated BMMC. Animals without liver injury were used as a control group. It was observed that 48 hours after transplantation, BMMC began to express hepatocyte-specific genes. In order to better understand the mechanisms involved in this differentiation, we used encapsulated BMMC in an in vitro model that replicates the characteristics of the in vivo model. So, we employed a co-culture system, where encapsulated BMMC were kept in contact with medium from hepatocytes with or without injury by CCl4. Our results showed that in just 6 hours of in vitro co-culture the encapsulated BMMC expressed hepatic markers. These results suggest the occurrence of BMMC differentiation at very early steps by paracrine mechanisms. Taken together, results shown here allow us to conclude that cellular microencapsulation proved to be a suitable tool to assess the processes that occur in acute liver injury in a bidirectional manner. Thus, we were able to observe the effect that bone marrow cells (both total and mononuclear fraction) exert on the injured liver tissue, as well as the effect that substances secreted by this tissue have on these cells.

A insuficiência hepática aguda é resultante da perda das funções vitais do fígado em consequência da disfunção maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos parácrinos da terapia com células em microcápsulas semipermeáveis, em modelos de insuficiência hepática aguda. Em uma primeira etapa animais submetidos a hepatectomia parcial de 90% foram transplantados com células da medula óssea (CMO) encapsuladas ou cápsulas vazias. Os resultados demonstraram um aumento na sobrevida em 10 dias nos animais tratados com CMO encapsuladas. Estudos em tempos iniciais da regeneração (em até 72 horas) demonstraram que as CMO reduziram a expressão de genes que favorecem a regeneração hepática e aumentaram a expressão de reguladores negativos da regeneração. Como consequência, houve uma diminuição da taxa de regeneração nos animais tratados. Este efeito ocorreu através de mecanismos parácrinos. Na segunda etapa avaliamos a capacidade de diferenciação das células da fração mononuclear da medula óssea (CFMMO) encapsuladas in vivo e in vitro. Animais submetidos a uma lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4) foram transplantados com CFMMO encapsuladas. Animais sem lesão hepática foram utilizados como controle. Observou-se que, 48 horas após o transplante as CFMMO passaram a expressar genes característicos de hepatócitos. A fim de estudar melhor os mecanismos envolvidos nesta diferenciação, utilizamos CFMM encapsuladas em um modelo in vitro que replicasse as características do modelo in vivo. Assim empregamos um sistema de co-cultivo, onde as CFMMO encapsuladas eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos com ou sem lesão por CCl4. Nossos resultados demonstraram que em apenas 6 horas de co-cultivo in vitro as CFMMO encapsuladas expressaram marcadores hepáticos. Estes resultados sugerem a ocorrência de diferenciação das CFMMO em tempos muito precoces por mecanismos parácrinos. Em conjunto, os resultados apresentados nos permitem concluir que a microencapsulação celular se mostrou uma ferramenta adequada para avaliar os processos que ocorrem na lesão hepática aguda de maneira bidirecional. Sendo assim, pudemos observar o efeito que as células da medula óssea (total ou fração mononuclear) exercem sobre o tecido hepático lesado, bem como o efeito que substâncias secretadas por este tecido têm sobre essas células. / Acute liver failure results from loss of the liver’s vital functions due to major dysfunction of hepatic tissue. In several cases, liver transplantation is the definitive treatment, despite the liver’s regenerative capacity. Regeneration mechanisms involve intricate regulatory pathways, with activation of growth factors and cytokines. Cell therapy with bone marrow stem cells has been proposed as a therapeutic alternative. However, its use remains in the experimental field. The objective of this study was to investigate paracrine effects of cell therapy in models of acute liver failure with the use semipermeable microcapsules. First, animals undergoing 90% partial hepatectomy were transplanted with encapsulated bone marrow cells (BMC) or empty capsules. Results showed an increase in 10-day survival in treated animals treated with encapsulated BMC. Studies performed at earlier steps (within 72 hours) demonstrated that BMC reduced expression of genes that promote liver regeneration and increased the expression of its negative regulators. As a consequence, there was a decrease in the rate of liver regeneration in treated animals, and this effect occurred through paracrine mechanisms. In the second study we evaluated the differentiation ability of encapsulated bone marrow mononuclear cells (BMMC) in vivo and in vitro. Animals submitted to carbon tetrachloride (CCl4) induced acute liver injury were transplanted with encapsulated BMMC. Animals without liver injury were used as a control group. It was observed that 48 hours after transplantation, BMMC began to express hepatocyte-specific genes. In order to better understand the mechanisms involved in this differentiation, we used encapsulated BMMC in an in vitro model that replicates the characteristics of the in vivo model. So, we employed a co-culture system, where encapsulated BMMC were kept in contact with medium from hepatocytes with or without injury by CCl4. Our results showed that in just 6 hours of in vitro co-culture the encapsulated BMMC expressed hepatic markers. These results suggest the occurrence of BMMC differentiation at very early steps by paracrine mechanisms. Taken together, results shown here allow us to conclude that cellular microencapsulation proved to be a suitable tool to assess the processes that occur in acute liver injury in a bidirectional manner. Thus, we were able to observe the effect that bone marrow cells (both total and mononuclear fraction) exert on the injured liver tissue, as well as the effect that substances secreted by this tissue have on these cells.

A insuficiência hepática aguda é resultante da perda das funções vitais do fígado em consequência da disfunção maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos parácrinos da terapia com células em microcápsulas semipermeáveis, em modelos de insuficiência hepática aguda. Em uma primeira etapa animais submetidos a hepatectomia parcial de 90% foram transplantados com células da medula óssea (CMO) encapsuladas ou cápsulas vazias. Os resultados demonstraram um aumento na sobrevida em 10 dias nos animais tratados com CMO encapsuladas. Estudos em tempos iniciais da regeneração (em até 72 horas) demonstraram que as CMO reduziram a expressão de genes que favorecem a regeneração hepática e aumentaram a expressão de reguladores negativos da regeneração. Como consequência, houve uma diminuição da taxa de regeneração nos animais tratados. Este efeito ocorreu através de mecanismos parácrinos. Na segunda etapa avaliamos a capacidade de diferenciação das células da fração mononuclear da medula óssea (CFMMO) encapsuladas in vivo e in vitro. Animais submetidos a uma lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4) foram transplantados com CFMMO encapsuladas. Animais sem lesão hepática foram utilizados como controle. Observou-se que, 48 horas após o transplante as CFMMO passaram a expressar genes característicos de hepatócitos. A fim de estudar melhor os mecanismos envolvidos nesta diferenciação, utilizamos CFMM encapsuladas em um modelo in vitro que replicasse as características do modelo in vivo. Assim empregamos um sistema de co-cultivo, onde as CFMMO encapsuladas eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos com ou sem lesão por CCl4. Nossos resultados demonstraram que em apenas 6 horas de co-cultivo in vitro as CFMMO encapsuladas expressaram marcadores hepáticos. Estes resultados sugerem a ocorrência de diferenciação das CFMMO em tempos muito precoces por mecanismos parácrinos. Em conjunto, os resultados apresentados nos permitem concluir que a microencapsulação celular se mostrou uma ferramenta adequada para avaliar os processos que ocorrem na lesão hepática aguda de maneira bidirecional. Sendo assim, pudemos observar o efeito que as células da medula óssea (total ou fração mononuclear) exercem sobre o tecido hepático lesado, bem como o efeito que substâncias secretadas por este tecido têm sobre essas células. / Acute liver failure results from loss of the liver’s vital functions due to major dysfunction of hepatic tissue. In several cases, liver transplantation is the definitive treatment, despite the liver’s regenerative capacity. Regeneration mechanisms involve intricate regulatory pathways, with activation of growth factors and cytokines. Cell therapy with bone marrow stem cells has been proposed as a therapeutic alternative. However, its use remains in the experimental field. The objective of this study was to investigate paracrine effects of cell therapy in models of acute liver failure with the use semipermeable microcapsules. First, animals undergoing 90% partial hepatectomy were transplanted with encapsulated bone marrow cells (BMC) or empty capsules. Results showed an increase in 10-day survival in treated animals treated with encapsulated BMC. Studies performed at earlier steps (within 72 hours) demonstrated that BMC reduced expression of genes that promote liver regeneration and increased the expression of its negative regulators. As a consequence, there was a decrease in the rate of liver regeneration in treated animals, and this effect occurred through paracrine mechanisms. In the second study we evaluated the differentiation ability of encapsulated bone marrow mononuclear cells (BMMC) in vivo and in vitro. Animals submitted to carbon tetrachloride (CCl4) induced acute liver injury were transplanted with encapsulated BMMC. Animals without liver injury were used as a control group. It was observed that 48 hours after transplantation, BMMC began to express hepatocyte-specific genes. In order to better understand the mechanisms involved in this differentiation, we used encapsulated BMMC in an in vitro model that replicates the characteristics of the in vivo model. So, we employed a co-culture system, where encapsulated BMMC were kept in contact with medium from hepatocytes with or without injury by CCl4. Our results showed that in just 6 hours of in vitro co-culture the encapsulated BMMC expressed hepatic markers. These results suggest the occurrence of BMMC differentiation at very early steps by paracrine mechanisms. Taken together, results shown here allow us to conclude that cellular microencapsulation proved to be a suitable tool to assess the processes that occur in acute liver injury in a bidirectional manner. Thus, we were able to observe the effect that bone marrow cells (both total and mononuclear fraction) exert on the injured liver tissue, as well as the effect that substances secreted by this tissue have on these cells.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%. Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias. Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células. Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017). Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento. / Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area. The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy. On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours postoperatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days. On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group. On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours posthepatectomy. These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.

O uso de células da medula óssea no tratamento da insuficiência hepática aguda é uma alternativa promissora, visto que o único tratamento disponível atualmente é o transplante hepático o qual, devido à falta de órgãos para transplante e complicações pós-cirúrgicas, está associado a uma alta mortalidade. O interesse na identificação de populações celulares capazes de se diferenciar em células tipo-hepatócitos tem ganhado grande atenção, não somente como uma promissora fonte de células para terapia celular de doenças hepáticas, mas também como potencial fonte celular para modelos in vitro de testes pré-clínicos de medicamentos, modelos para estudo da hepatogênese, e desenvolvimento de fígados bioartificiais. O presente estudo teve como objetivo identificar a capacidade de diferentes populações de células da fração mononuclear da medula óssea (FMMO) de se diferenciar em células tipo-hepatócitos. Para isso, utilizamos um sistema de co-cultivo, onde as células da fração aderente e nãoaderente da FMMO eram mantidas em contato com o meio de hepatócitos derivados de animais com ou sem lesão por Tetracloreto de Carbono (CCl4). Nossos resultados mostram que células da fração não-aderente são capazes de adquirir características típicas de hepatócitos após 24 horas de exposição às células do tecido lesionado, tais como expressão gênica de Albumina e Citokeratina-18, e produção e secreção de uréia. Foi identificada a presença de microvesículas carregando material genético específico de hepatócitos no sobrenadante das células diferenciadas, indicando um possível mecanismo molecular na indução da diferenciação. Este trabalho permitiu o estudo da diferenciação celular in vitro e análise do papel do microambiente de lesão neste processo. / Cell therapy using bone marrow-derived cells is a promising approach for the treatment of acute liver failure, as liver transplant is associated to high mortality due to lack of organs and post-surgical complications. The identification of cell populations capable of generating hepatocyte-like cells has gained immense interest, not only as a promising cell source for cell-based therapy of liver diseases, but also as a potential cell source for in vitro models of drug safety testing, models for studying hepatogenesis, and development of bioartificial livers. In the present study, we investigated the capability of different populations from the bone marrow mononuclear cells (BMMC) to differentiate into hepatocyte-like cells. For that, adherent and non-adherent cells from the BMMC were co-cultured with hepatocytes obtained from animals with or without Carbon Tetrachloride (CCl4)-induced liver injury. Our results showed that non-adherent BMMC presented signs of differentiation, such as Albumin and Cytokeratin-18 expression and urea production, after 24 hours of co-culture with damaged hepatocytes. Microvesicles carrying hepatocyte-specific genetic material were detected in the supernatant from differentiated cells, thus suggesting a mechanism of differentiation. In summary, this study assessed in vitro differentiation of BMMC and analyzed the role of injury micro-environment in cell plasticity.

A insuficiência hepática aguda resulta da perda súbita das funções vitais do fígado em conseqüência da perda maciça do tecido hepático. Em muitos casos, o transplante de fígado de urgência é o tratamento definitivo, apesar da capacidade regenerativa do fígado. Os mecanismos da regeneração envolvem intricadas vias de regulação, com ativação de fatores de crescimento e citocinas. A terapia celular com hepatócitos e células tronco da medula óssea tem sido proposta como alternativa terapêutica, mas seu emprego permanece no campo experimental. O presente estudo teve por objetivo investigar os efeitos da terapia com células imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio na sobrevivência e na regeneração hepática em ratos Wistar machos adultos submetidos à insuficiência hepática aguda. Na primeira fase foi realizada a padronização de modelo de insuficiência hepática aguda por hepatectomia de 85% ou 90% com janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A segunda fase teve por objetivo avaliar os efeitos da terapia com células HepG2 e células da medula óssea total (MOT) e fração mononuclear (FM), contidas em microcápsulas de alginato de sódio colocadas no peritônio, sobre os níveis de glicose e lactato sanguíneos e sobre a sobrevida em 10 dias. Na fase 3, foram avaliados os efeitos da terapia celular com MOT e FM sobre a proliferação hepatocitária e os níveis séricos de citocinas e de fatores de crescimento nas primeiras 72 horas após hepatectomia de 90%. Na fase 1, mesmo utilizando ketamina e xilazina como anestésico e independentemente da suplementação de glicose, hepatectomia de 85% resultou em sobrevida de 50% em 72 horas, não adequada a um modelo de insuficiência hepática aguda. Hepatectomia de 90% sob anestesia com ketamina e xilazina determinou aumento da mortalidade, com a maioria dos óbitos ocorrendo nas primeiras 6 horas do pós-operatório. A troca do regime anestésico para isoflurano reduziu o tempo de recuperação anestésica e aumentou a sobrevida imediata permitindo uma janela terapêutica adequada. A sobrevida foi de 26,7% às 72 horas e de 6,7% aos 10 dias. Na fase 2 foram administradas microcápsulas contendo células em ratos submetidos a hepatectomia de 90%. O transplante de células da medula óssea aumentou a sobrevida em 10 dias de forma significativa em relação ao grupo sem células (MOT 1x106 células: 63,6%, P=0,002; FM 1x106: 57,1%, P=0,001 e FM 3x107: 54,5%, P=0,003). A sobrevida (30,8%) dos animais tratados com HepG2 não foi diferente do grupo sem células. Na terceira fase, às 72 horas após a hepatectomia, o grupo sem células apresentou peso dos lobos remanescentes e razão de massa hepática significativamente superiores aos dos animais que receberam MOT (P=0,001 e P=0,020) e FM (P=0,002 e P=0,008). Não houve diferença estatística significativa no número de hepatócitos em mitose e nos níveis de IL-6 entre os grupos em todos os momentos avaliados. Somente às 12 horas houve diferença significativa dos níveis de TGF-beta entre os grupos, sendo maiores no grupo sem células (P=0,036). Os valores do PDGF-BB às 48 horas do grupo sem células foram significativamente inferiores aos dos ratos tratados com FM (P=0,017). Esses resultados nos permitem concluir que hepatectomia de 90% de ratos Wistar anestesiados com isoflurano possibilita janela terapêutica adequada ao estudo da terapia celular. A terapia com células da medula óssea, imobilizadas em microcápsulas de alginato de sódio resulta em aumento da sobrevida de ratos submetidos à hepatectomia de 90%. Essa terapêutica reduziu o ganho de massa dos lobos remanescentes, mas não modificou a regeneração hepatocitária e os níveis de IL-6, de TGF-beta e de PDGF-BB durante as primeiras 72 horas após o procedimento. / Acute liver failure is caused by the sudden loss of liver vital functions due to massive loss of hepatic tissue. In most cases, emergency liver transplant is the curative treatment, despite liver’s regenerative capacity. Mechanisms of liver regeneration involve intricate regulatory pathways, with the recruitment of growth factors and cytokines. Cell therapy, either with hepatocytes or with bone marrow cells, has been proposed as a therapeutic option but remains in the experimental area. The present study aimed to investigate the effects of the therapy with cells immobilized in alginate microcapsules on the survival and hepatic regeneration of adult male Wistar rats with acute liver failure. On the first phase the acute liver failure model by 85% or 90% hepatectomy was standardized to achieve an adequate therapeutic window to study the mechanisms and effects of cell therapy. The second phase aimed to evaluate the effects of therapy using Hep G2 cells and bone marrow cells, either whole bone marrow (WBM) or mononuclear fraction (MF), in alginate microcapsules implanted in the peritoneum, on glucose and lactate levels, and 10-day survival. On phase 3, the effects of cell therapy with WBM and MF on hepatocyte proliferation and serum levels of cytokines and growth factors were evaluated in the first 72 hours after 90% hepatectomy. On phase 1, using ketamine and xylazine as anesthetic, despite glucose supplementation, 85% hepatectomy resulted in 50% survival at 72 hours, which is not adequate for a model of acute liver failure. Ninety-percent hepatectomy under ketamine and xylazine anesthesia resulted in increased mortality, although in the first 6 hours postoperatory. The change in anesthetic regimen for isofluorane reduced recovery time and increased early survival, allowing for an adequate therapeutic window. Survival was 26.7% at 72 hours and 6.7% at 10 days. On phase 2 microcapsules containing cells were implanted in rats after 90% hepatectomy. Bone marrow cell transplantation significantly increased 10-day survival over empty capsules group (WBM 1x106 cells: 63.6%, P=0.002; MF 1x106: 57.1%, P=0.001 and MF 3x107: 54.5%, P=0.003). Survival of animals treated with HepG2 (30.8%) was not different from empty capsules group. On the third phase, 72 hours after hepatectomy, empty capsules group showed significantly increase in the weight of remnant liver lobe and hepatic mass ratio compared to WBM (P=0.001 and P=0.020) and MF (P=0.002 and P=0.008). There was not statistic difference in the number of mitotic hepatocytes and in the serum levels of IL-6 between groups in any of the time points analyzed. Serum levels of TGF-beta were higher in the empty capsules group at 12 hours only (P=0.036). Serum levels of PDGF-BB in this group were significantly lower (P=0.017) than those from the MF group at 48 hours posthepatectomy. These findings suggest that 90% partial hepatectomy in Wistar rats anesthetized with isoflurane provides an adequate therapeutic window to study the effects and mechanisms of cell therapy. Cell therapy with bone marrow cells microencapsulated in alginate beads leads to increased survival in rats with 90% partial hepatectomy. This therapy reduced the weight of remnant lobes but did not changed hepatocyte regeneration and serum levels of IL-6, TGF-beta and PDGF-BB in the first 72 hours after surgery.