O desenvolvimento do padrão de segmentação de Drosophila é estabelecido por uma cascata de genes de segmentação zigóticos. Estes genes são divididos em três classes (gap, pair-rule e segment-polarity) e codificam para fatores de transcrição (FT) que se ligam a módulos cis-reguladores (CRMs), reprimindo ou ativando genes alvo. A faixa 2 do gene pair-rule even-skipped (eve 2) é ativada pelos fatores maternos Bicoid e Hunchback e reprimida pelas proteínas gap Giant (Gt) e Krüppel. Estudos posteriores mostraram que o FT Sloppy-paired 1 (Slp 1) e provavelmente um outro FT forkhead também atuam na repressão de eve 2. O gene anotado CG9571 foi isolado em uma varredura como proteína forkhead candidata a repressão de eve 2. Estudos genéticos confirmaram essa possibilidade e revelaram que eve 1 também pode ser alvo deste FT. Este trabalho teve como objetivo verificar a interação de CG9571 com os CRMs eve 1 e eve 2. Para tanto, planejamos obter o domínio de ligação da proteína (CG9571 BD) e da proteína completa (CG9571 FL) e testar suas interações in vitro com fragmentos dos CRMs por meio da técnica de retardo da mobilidade eletroforética (EMSA). Obtivemos a quantidade necessária de DNA para os experimentos através de PCR e preparações plasmidiais de versões clonadas destes CRMs que já dispúnhamos em laboratório. Realizamos tentativas de obtenção de CG9571 BD por transcrição e tradução in vitro, mas esta estratégia não foi bem-sucedida e adotamos a estratégia de clonagem em vetor para expressão em células competentes bacterianas. O fragmento de CG9571 BD foi clonado com sucesso, mas não conseguimos verificar a expressão do polipeptídeo em duas linhagens de E. coli. Alteramos novamente nossa estratégia e clonamos o fragmento correspondente a CG9571 FL em vetor de expressão e conseguimos induzir sua expressão em bactéria, embora não tenha sido obter a proteína recombinante em forma solúvel. Prosseguimos para tentativas de recuperação da proteína a partir de corpos de inclusão. Foram empregados diferentes métodos para solubilização, renovelamento e purificação da proteína. Extratos da fração insolúvel solubilizada em diferentes concentrações de ureia foram submetidos a tentativas de purificação e renaturação por cromatografia de afinidade, mas não houve adsorção significativa de CG9571 FL em colunas com Ni2+ imobilizado. Preparações não puras contendo CG9571 FL foram obtidas através de procedimentos de renaturação destes extratos e foram utilizadas em ensaios de interação com os CRMs. Não houve detecção de retardo da mobilidade eletroforética dos fragmentos em gel. Foram observados efeitos de redução da quantidade de DNA detectado com brometo de etídio nas interações, mas este efeito foi considerado produto da ação de possíveis nucleases contaminantes nas preparações após investigação. Preparações de CG9571 FL puras foram obtidas por purificações a partir de SDS-PAGE, mas a maioria das interações da proteína solúvel com eve 1 e eve 2 não indicou formação de complexo. Obtivemos um único resultado positivo para a interação entre CG9571 FL e eve 2. Por não ter sido reproduzido, consideramos o resultado inconclusivo e novos experimentos serão conduzidos para dar continuidade à investigação da hipótese do trabalho / The development of Drosophila segmentation pattern is established by a cascade of zygotic segmentation genes. The zygotic genes are grouped in three classes (gap, pair-rule and segment-polarity) and code for transcription factors (TF) that bind to cis-regulatory modules (CRMs) with activation or repression roles. The stripe 2 of the pair-rule gene even-skipped (eve 2) is activated by the maternal factors Bicoid and Hunchback and repressed by the gap proteins Giant and Krüppel. Later studies showed that Sloppy-paired 1 (Slp 1) and probably another forkhead transcription factor also act for eve 2 repression. The annotated gene CG9571 was isolated in a search for putative forkhead protein repressors of eve 2. Genetic studies confirmed this possibility and reveled that eve 1 could also be a target for this TF. The aim of this work was to verify the interaction of CG9571 with the CRMs eve 1 and eve 2. To reach this aim, we planned to obtain the binding domain of the protein (CG9571 BD) or of the full-length protein (CG9571 FL) and to test their in vitro interactions with the eve 1 and eve 2 fragments by the electrophoretic mobility shift assay (EMSA). We obtained the necessary amount of DNA for the tests by PCR and plasmidial preparations of cloned versions of these CRMs that we already had in our laboratory. We made attempts to obtain CG9571 BD by in vitro transcription and translation system, but this strategy did not work and we adopted the cloning strategy to obtain the protein expressed by bacterial competent cells. CG9571 BD was cloned successfully, but we were not able to detect the polypeptide expression in two E. coli strains. We then turned to the CG9571 FL protein that we cloned and succeed to express it in bacteria, although we were not able to obtain the soluble recombinant form. We proceed for attempts of protein recovering from inclusion bodies. Different methods for solubilization, refolding and purification of the proteins were used. Extracts of the insoluble fraction solubilized in solutions with different urea concentrations were used in attempts of refolding and purification by affinity chromatography, but there was not significant CG9571 FL adsorption on columns with Ni2+ immobilized. We obtained impure preparations with CG9571 FL through procedures of refolding of these extracts and employed them on binding assays with the CRMs, but there was no gel shift detection. We observed reduction of the amount of DNA present in the binding reaction samples detected by ethidium bromide, but after further investigations this effect was considered the product of contaminant nuclease reaction from bacteria. Pure preparations of CG9571 FL were obtained by purification from SDS-PAGE, but there was no indication of complex formation on the most binding reaction assays with eve 1 and eve 2. We obtained only one positive result for the interaction between CG9571 FL and eve 2. However, the result was considered inconclusive because we were not able to reproduce it and new experiments will be conducted to investigate the hypothesis of this work

Orientador: Maria Isabel Nogueira Cano / Resumo: Entre as espécies do gênero Leishmania estão os protozoários que causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Métodos de controle e tratamento ainda são ineficientes e a resistência a drogas é um desafio. Por isso, pesquisas para entender melhor a biologia molecular desses parasitos são encorajadas. Uma possível estratégia para isso, é o estudo dos telômeros, estrutura fundamental para a homeostase do genoma. Os telômeros são estruturalmente diferentes do resto do cromossomo, e contam com proteínas específicas que realizam sua manutenção. A Replication Protein A subunit 1 (RPA-1) é uma proteína que interage de DNA de simples fita que tem diversas funções relacionadas com o metabolismo do DNA eucarioto, incluindo os telômeros. A RPA-1 é parte de um complexo heterotrimérico conservado nos eucariotos, incluindo Leishmania spp.. Recentemente nós mostramos por modelagem molecular que a estrutura terciária da LaRPA-1 difere dos seus ortólogos em humanos e leveduras, além de mostrar interações específicas nos telômeros dos parasitos, que na ausência de homólogos canônicos para telomere-end binding protein (TEP) elegem a LaRPA-1 como um potencial candidato para essa função. Neste trabalho, avaliamos a capacidade da LaRPA-1 como uma TEP, cujo papel principal é proteger a extremidade 3' dos telômeros de ataques por exonucleases. Uma busca estrutural por proteínas que compartilham com as TEP domínios de interação proteína-DNA, mos... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Among the protozoa parasites of the Leishmania genus are the causative agents of leishmaniasis, a neglected tropical disease endemic in many countries, including Brazil. Disease control and treatment are still inefficient and parasite drug resistance is a challenge. Therefore, efforts for the establishment of intensive research to better understand the molecular biology of these parasites are encouraged. One possible strategy is to study parasite telomeres, a vital chromosome structure important to maintain genome homeostasis. Telomeres are significantly different from the rest of the chromosome and are associated with proteins involved in their maintenance. Replication Protein A subunit 1 (RPA1), a single-stranded DNA-binding protein that plays multiple roles in eukaryotic DNA metabolism, including telomeres, is part of a conserved heterotrimeric complex which is present in most eukaryotes including Leishmania spp. Recently, using molecular dynamics simulations we have shown that the tertiary structure of LaRPA-1 differs from human and yeast RPA-1 and that it also shows parasitespecific interactions with telomeric DNA. In the absence of real homologues to telomere-end binding proteins, LaRPA-1 could be considered a potential candidate. If LaRPA-1 is a telomere-end binding protein, one of its main role would be to protect the telomeric 3`-end termini from nuclease attack. A structural search for proteins that share with the TEP domains of protein-DNA interaction, showed that ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Gabriel Arantes Galvão Dias dos Santos (arantes_gabriel@hotmail.com) on 2018-05-14T15:21:05Z No. of bitstreams: 1 Dissertação pós defesa.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-05-14T17:46:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 santos_gagd_me_bot.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-14T17:46:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 santos_gagd_me_bot.pdf: 3303163 bytes, checksum: 01b3ceab15b6016a9aaca279d39ebdc5 (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Entre as espécies do gênero Leishmania estão os protozoários que causam leishmaniose, uma doença tropical negligenciada endêmica em muitos países, incluindo o Brasil. Métodos de controle e tratamento ainda são ineficientes e a resistência a drogas é um desafio. Por isso, pesquisas para entender melhor a biologia molecular desses parasitos são encorajadas. Uma possível estratégia para isso, é o estudo dos telômeros, estrutura fundamental para a homeostase do genoma. Os telômeros são estruturalmente diferentes do resto do cromossomo, e contam com proteínas específicas que realizam sua manutenção. A Replication Protein A subunit 1 (RPA-1) é uma proteína que interage de DNA de simples fita que tem diversas funções relacionadas com o metabolismo do DNA eucarioto, incluindo os telômeros. A RPA-1 é parte de um complexo heterotrimérico conservado nos eucariotos, incluindo Leishmania spp.. Recentemente nós mostramos por modelagem molecular que a estrutura terciária da LaRPA-1 difere dos seus ortólogos em humanos e leveduras, além de mostrar interações específicas nos telômeros dos parasitos, que na ausência de homólogos canônicos para telomere-end binding protein (TEP) elegem a LaRPA-1 como um potencial candidato para essa função. Neste trabalho, avaliamos a capacidade da LaRPA-1 como uma TEP, cujo papel principal é proteger a extremidade 3' dos telômeros de ataques por exonucleases. Uma busca estrutural por proteínas que compartilham com as TEP domínios de interação proteína-DNA, mostrou que no genoma de Leishmania spp. não existem homólogos estruturais para as mesmas. Aqui mostramos por diferentes abordagens que a LaRPA-1 tem a capacidade de interagir com no mínimo uma repetição telomérica e também é capaz de proteger in vitro a simples fita telomérica rica em G (5’ TTAGGG 3’) da digestão por Exonuclease I bacteriana cuja atividade é no sentido 3’-5’. Somando esses dados, com dados anteriores que mostram que a LaRPA-1 tem preferência pela fita telomérica rica em G e o fato dela ter sido co-purificada com a atividade de telomerase sugerem fortemente que ela está diretamente relacionada com a manutenção da maquinaria telomérica, podendo inclusive ser considerada a principal ligante de simples fita telomérica rica em G (3’ G-overhang) em Leishmania spp. / Among the protozoa parasites of the Leishmania genus are the causative agents of leishmaniasis, a neglected tropical disease endemic in many countries, including Brazil. Disease control and treatment are still inefficient and parasite drug resistance is a challenge. Therefore, efforts for the establishment of intensive research to better understand the molecular biology of these parasites are encouraged. One possible strategy is to study parasite telomeres, a vital chromosome structure important to maintain genome homeostasis. Telomeres are significantly different from the rest of the chromosome and are associated with proteins involved in their maintenance. Replication Protein A subunit 1 (RPA1), a single-stranded DNA-binding protein that plays multiple roles in eukaryotic DNA metabolism, including telomeres, is part of a conserved heterotrimeric complex which is present in most eukaryotes including Leishmania spp. Recently, using molecular dynamics simulations we have shown that the tertiary structure of LaRPA-1 differs from human and yeast RPA-1 and that it also shows parasitespecific interactions with telomeric DNA. In the absence of real homologues to telomere-end binding proteins, LaRPA-1 could be considered a potential candidate. If LaRPA-1 is a telomere-end binding protein, one of its main role would be to protect the telomeric 3`-end termini from nuclease attack. A structural search for proteins that share with the TEP domains of protein-DNA interaction, showed that in the genome of Leishmania spp. there are no structural homologues for them. In this work, we show by different methods, that in vitro LaRPA-1 can bind at least one telomeric repeat and it can also protect the telomeric G-rich sequence (5’ TTAGGG 3’) from the bacterial 3’-5’Exonuclease I digestion. These data compiled to previous data showing that LaRPA-1 preferentially binds the G-rich telomeric DNA and that it co-purifies with telomerase activity strongly suggest that LaRPA-1 is directly involved with parasite telomere maintenance and, possibly, is the main G-rich single-stranded (3’ G-overhang) telomere-binding protein in Leishmania spp.