Redes complexas são utilizadas para representar sistemas complexos, compostos de elementos que interagem uns com os outros. Uma das grandes vantagens de se empregar as redes é a possibilidade de se estudar a topologia presente nos mais diversos sistemas para obtermos informações sobre eles, entendê-los e compará-los. Devido à sua importância para a compreensão de processos intracelulares, desde início do desenvolvimento da área das redes complexas estudou-se a topologia da interação entre proteínas. Entretanto nos últimos anos com o desenvolvimento de novas técnicas de detecção o número de proteínas e interações reportadas cresceu de maneira muito acentuada; além disso, também existem alguns pontos sobre a sua topologia sobre os quais ainda não existe um consenso, como por exemplo qual a distribuição de graus desse tipo de rede. Neste trabalho estudamos as propriedades topológicas de redes de interação entre proteínas, utilizando as informações do banco de dados STRING, com ênfase no comportamento de suas medidas de centralidade e do espectro da matriz Laplaciana normalizada. Tanto a análise das medidas de centralidade e de suas correlações, quanto do espectro da matriz Laplaciana mostram que existem padrões topológicos que são conservados entre as redes dos organismos e que os mesmos também podem ser empregados para sua caracterização. Nossos resultados também mostram que as funções biológicas desempenhadas pelas proteínas podem ser identificadas pelas medidas de centralidade. Especificamente para a centralidade de autovetor, nossas análises indicam que ela está localizada nos maiores K-cores das redes consideradas. Os resultados aqui obtidos ressaltam que muitas informações relevantes podem ser extraídas da topologia das interações entre proteínas, além de indicarem a existência de possíveis estruturas conservadas; entretanto devido a incompletude dessas redes mais estudos precisam ser conduzidos para a avaliação de possíveis mudanças nos resultados aqui apresentados. / Complex networks can be used to model complex systems, composed of main elements that interact with each other. The advantage of using this approach is the possibility to study the topology of a wide range of systems so that we can get more information, understand and compare them. Due to its importance on the understanding of the intracellular biological processes, since the early beginning of the development of the complex networks field protein-protein interaction topologies have been studied. However, new techniques for the detection of proteins and their interactions have been developed recently, which has significantly increased the availability and reliability of the corresponding data over the last few years; moreover, there still are some debate about the topology of protein-protein interaction networks such as the degree distribution of this type of network. Here we will study the topological properties of protein-protein interaction networks created using the information of the STRING database focusing on centrality measures of their nodes, the correlation between them, and the normalized Laplacian matrix spectrum. Our results show the existence of topological patterns conserved between the protein interaction networks of different organisms and that both the correlation of the centrality pairs and the spectrum of the Laplacian matrix can be used for network characterization. Another study indicates that the set of centrality measures of a protein can be used to identify clusters with well defined biological functions. A more detailed look at the eigenvector centrality behavior reveals that this measure is localized on the proteins of the highest k-cores for all networks. These results highlight the importance of the topology on the study of protein-protein interactions and that more studies can lead to a better a more complete understanding of such systems.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

Um dos principais componentes envolvidos no processo de divisão celular bacteriana é FtsZ, uma proteína homóloga à tubulina eucariótica. FtsZ polimeriza no interior da célula formando um anel ao qual dá-se o nome de anel Z, responsável pelo recrutamento de diversas outras proteínas de divisão, formando o divisomo. Como meio de sobrevivência sob condições adversas, alguns procariotos, como B. subtilis, podem sofrer um tipo de diferenciação celular que forma um organismo em estado latente, conhecido como esporo. A primeira etapa da formação do esporo é a mudança da posição do anel Z para mais próximo a um dos pólos da célula, produzindo duas células com tamanhos diferentes. SpoIIE é uma proteína fosfatase integral de membrana, que se localiza especificamente no septo assimétrico de uma célula em processo de esporulação. Além de um papel na ativação do fator de transcrição de esporulação σF, SpoIIE se liga a FtsZ e a auxilia na formação do septo assimétrico. Para definirmos a região de FtsZ responsável pela interação com SpoIIE, neste trabalho foram realizados ensaios de duplo-híbrido utilizando vetores com domínios de ativação e de ligação ao DNA do fator de transcrição GAL4 de levedura fusionados a diferentes porções de FtsZ, bem como a SpoIIE. Esses experimentos não forneceram informações sobre interação entre essas proteínas, já que através deles não foi possível reproduzir o resultado positivo descrito na literatura. Como alternativa ao duplo-hibrido para identificarmos o sítio de interação entre as duas proteínas, criamos uma triagem genética capaz de identificar mutantes de FtsZ que não interagem com SpoIIE, fazendo uso de uma biblioteca de mutantes de FtsZ já disponível no laboratório. Foi padronizada uma técnica de microscopia em larga escala em placas de 96 poços, que permitiu a triagem de mais de mil de mutantes de FtsZ, em busca de um em que SpoIIE-GFP induzido não localizasse no anel Z em célula vegetativa. Porém todos os mutantes triados ainda localizavam SpoIIE-GFP. Paralelamente, foi realizada uma triagem de supressão, utilizando como ponto de partida um mutante de SpoIIE que perdeu capacidade de interagir com FtsZ e buscando mutações em FtsZ que reestabelecessem a interação com SpoIIE mutante. Foram triados cerca de 35000 mutantes nesse ensaio, dentre os quais dezoito apresentaram o fenótipo esperado para um supressor. No entanto, todos os candidatos selecionados tratavam-se de falsos-positivos. O motivo que leva esses candidatos a apresentarem o fenótipo esperado sem reestabelecer a interação entre as duas proteínas ainda é desconhecido. A fim de confirmar se não haveria outras proteínas do divisomo responsáveis por intermediar a interação entre FtsZ e SpoIIE, foram feitos experimentos de co-localização de FtsZ e SpoIIE na ausência de DivIB e FtsA. Em ambos os casos SpoIIE ainda localiza no divisomo, descartando a possibilidade de que DivIB e FtsA sejam mediadores da interação FtsZ-SpoIIE. Por fim, foram realizados experimentos de co-localização de SpoIIE com mutantes de FtsZ previamente identificados em outros experimentos em nosso laboratório. Nesse experimento foi identificado que a expressão de SpoIIE-GFP induzida por IPTG é capaz de reestabelecer a frequência de divisão no mutante FtsZ-R376T, que normalmente é deficiente na formação de divisomos. Esse resultado reforça a idéia de que essas proteínas interagem diretamente, e sugere que SpoIIE é capaz de reestabelecer a atividade de FtsZ em um mutante que apresente falhas na polimerização. / One of the major components involved in bacterial cell division is FtsZ, a protein homologous to the eukaryotic tubulin. FtsZ polymerizes inside the cell forming a ring to which is given the name Z ring, wich is responsible for the recruitment of several other proteins division, forming the divisome. As a means of survival under adverse conditions, some prokaryotes such as B. subtilis may undergo a type of cell differentiation that results in an organism in a latent state, known as a spore. The first stage of the spore formation is to change the Z ring position closer to the poles of the cell, producing two cells of different sizes. SpoIIE is an integral membrane phosphatase protein, which is specifically located in the septum of an asymmetric cell in sporulation process. In addition to a role in the activation of the sporulation transcription factor σF, SpoIIE binds to FtsZ and assists in the formation of the asymmetric septum. To define the FtsZ region responsible for interaction with SpoIIE, in this work we performed tests using two-hybrid vectors with activation and DNA binding domains of the yeast transcription factor GAL4 fused to different portions of FtsZ and SpoIIE. These experiments did not provide information on the interaction between these proteins, since through them it was not possible to reproduce the positive results reported in the literature. As an alternative to the two-hybrid to identify the site of interaction between the two proteins, we created a genetic screening that can identify FtsZ mutants that cannot interact with SpoIIE, using a library of FtsZ mutants already available in the laboratory. We standardized a large scale microscopy using 96-well plates, allowing the screening of over a thousand mutants of FtsZ in search of a induced SpoIIE-GFP which would no longer localize at the vegetative cell Z ring. However, all the screened mutants still localized SpoIIE-GFP. In parallel, we performed a screening of suppression, using as a starting point a SpoIIE mutant that lost the ability to interact with FtsZ and searching for mutations in FtsZ that would reestablish interaction with the SpoIIE mutant. We screened approximately 35,000 mutants in this essay, eighteen of which showed the phenotype expected for a suppressor. However, all selected candidates were false positives. The reason why such candidates do show the expected phenotype without reestablishment of the interaction between the two proteins is still unknown. In order to confirm whether there would be other divisiome proteins responsible for mediating the interaction between FtsZ and SpoIIE, co-localization experiments were made using FtsZ and SpoIIE in the absence of DivIB and FtsA. In both cases SpoIIE still located in divisome, ruling out the possibility that DivIB and FtsA are essencial mediators of the SpoIIE-FtsZ interaction. Finally, co-localization experiments were carried out with SpoIIE and FtsZ mutants previously identified in other experiments in our laboratory. In this experiment it was identified that the expression of IPTG-induced SpoIIE-GFP is able to restore the division frequency in the FtsZ-R376T mutant, which normally is deficient in the formation of divisomes. This result reinforces the idea that these proteins interact directly, and suggests that SpoIIE is able to restore the activity of FtsZ in a mutant that presents defect in polymerization.

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.