O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes agentes tensoativos não-iônicos (C10E4 e Triton X-114), temperatura e adição de ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e sulfato de sódio (Na2SO4). Estudou-se ainda a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema Triton X-114/tampão como para C10E4/tampão, no qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1. A utilização dos ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno aumento nos valores de KG6PD da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação do homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma, o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num processo biotecnológico. / In this work, the use of two-phase micellar system was studied aiming at the purification of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Usually, these systems are constituted of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic and hydrophilic environments, providing selectivity to the enzyme partitioning according to its hydrophobicity. Some of the factors influencing the G6PD partition in micellar systems were studied, such as: type and concentration of nonionic surfactant agents (C10E4 and Triton X-114), temperature, addition of affinity ligands (Cibacron Blue and Procion Red) and the addition of the salts ammonium sulfate ((NH4)2SO4) and sodium sulfate (Na2SO4). The synthesis of the affinity surfactant TX-114-Blue was also studied. In all the assays the experiments, G6PD partitioned preferentialy to dilute, micelle-poor phase, in which there is a higher volume available for the enzyme to be, resulting in KG6PD values lower than 1. The use of affinity ligands in G6PD partitioning in both C10E4 and Triton X-114 systems provided some increase in the KG6PD, however with values still lower than 1. Employing a methodology previously described in the literature with some alterations, it was not possible to obtain the affinity surfactant TX-114-Blue. The systems Triton X-114/salt have not shown a significant influence on the enzyme partition to the micelle-rich phase, in spite of the existence of an electrostatic potential difference between the phases of the systems. The excluded-volume effect was dominant in all the systems studied and, therefore, the enzyme predominantly excluded to the dilute, micelle-poor phase. The use of Triton X-114 two-phase aqueous micellar systems to the purification of the Saccharomyces cerevisiae cell homogenate was found to be efficient in the recovery of G6PD in the dilute, micelle-poor phase, partially separating this target molecule from other proteins and contaminants of hydrophobic character. Therefore, aqueous two-phase micellar systems can be considered useful as a possible purification stage in a biotechnology process.

O presente trabalho teve como objetivo a purificação da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase pela tecnologia de extração líquido-líquido em Sistemas Micelares de Duas Fases Aquosas (SMDFA). Estes sistemas são constituídos por soluções de tensoativos contendo micelas e oferecem ambientes hidrofóbico e hidrofílico, o que possibilita seletividade na partição da enzima de acordo com sua hidrofobicidade e proporciona um ambiente ameno às biomoléculas. Foram estudados alguns dos fatores que influenciam a partição da G6PD, como: tipo e concentração de diferentes agentes tensoativos não-iônicos (C10E4 e Triton X-114), temperatura e adição de ligantes de afinidade (cibacron blue e procion red) e o efeito da adição dos sais sulfato de amônio ((NH4)2SO4) e sulfato de sódio (Na2SO4). Estudou-se ainda a síntese do tensoativo de afinidade TX-114-Blue. Em todos os ensaios a enzima foi recuperada preferencialmente na fase diluída, pobre em micelas, tanto em sistema Triton X-114/tampão como para C10E4/tampão, no qual existe maior volume disponível, resultando em valores de KG6PD inferiores a 1. A utilização dos ligantes de afinidade na partição da G6PD nos sistemas descritos proporcionou um pequeno aumento nos valores de KG6PD da enzima, porém com valores inferiores a 1. Os sistemas Triton X-114/Sal não influenciaram a partição da enzima para a fase micelar, apesar da existência da diferença de potencial eletrostático entre as fases destes sistemas. O efeito desempenhado pelo volume de exclusão foi dominante em todos os sistemas estudados e, portanto, a enzima foi predominantemente excluída para a fase aquosa, pobre em micelas. A tecnologia por SMDFA para a purificação do homogeneizado celular de Saccharomyces cerevisiae demonstrou ser eficiente em recuperar a biomolécula alvo na fase aquosa, pobre em micelas, permitindo separar da presença de biomoléculas ou mesmo de contaminantes com caráter hidrofóbico. Dessa forma, o SMDFA pode ser empregado como uma possível etapa de purificação num processo biotecnológico. / In this work, the use of two-phase micellar system was studied aiming at the purification of the enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase. Usually, these systems are constituted of micellar surfactants solutions and offer both hydrophobic and hydrophilic environments, providing selectivity to the enzyme partitioning according to its hydrophobicity. Some of the factors influencing the G6PD partition in micellar systems were studied, such as: type and concentration of nonionic surfactant agents (C10E4 and Triton X-114), temperature, addition of affinity ligands (Cibacron Blue and Procion Red) and the addition of the salts ammonium sulfate ((NH4)2SO4) and sodium sulfate (Na2SO4). The synthesis of the affinity surfactant TX-114-Blue was also studied. In all the assays the experiments, G6PD partitioned preferentialy to dilute, micelle-poor phase, in which there is a higher volume available for the enzyme to be, resulting in KG6PD values lower than 1. The use of affinity ligands in G6PD partitioning in both C10E4 and Triton X-114 systems provided some increase in the KG6PD, however with values still lower than 1. Employing a methodology previously described in the literature with some alterations, it was not possible to obtain the affinity surfactant TX-114-Blue. The systems Triton X-114/salt have not shown a significant influence on the enzyme partition to the micelle-rich phase, in spite of the existence of an electrostatic potential difference between the phases of the systems. The excluded-volume effect was dominant in all the systems studied and, therefore, the enzyme predominantly excluded to the dilute, micelle-poor phase. The use of Triton X-114 two-phase aqueous micellar systems to the purification of the Saccharomyces cerevisiae cell homogenate was found to be efficient in the recovery of G6PD in the dilute, micelle-poor phase, partially separating this target molecule from other proteins and contaminants of hydrophobic character. Therefore, aqueous two-phase micellar systems can be considered useful as a possible purification stage in a biotechnology process.

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.

Neste trabalho, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-X a baixos Ângulos (SAXS) para estudar a influência de dois derivados fenotiazínicos na estrutura de sistemas micelares, assim como suas propriedades de auto-associação, além de investigar a influência da variação de pH e de concentração nas interações entre proteínas em solução. Para tanto, utilizamos dois fármacos fenotiazínicos, (Trifluoperazina, TFP e a Clorpromazina, CPZ), em presença de L--fosfatidilcolina (LPC), um surfactante zwiteriônico (30 mM), a pH 4.0 e 7.0. Os resultados de SAXS indicam que a micela de LPC, em ausência de fenotiazina, pode ser representada por uma micela com forma elipsoidal (com razão axial 1.6 0.1). No entanto, em presença de TFP e de CPZ a forma da micela se altera, passando para um cilindro (com razão axial 2.5 0.1). Este efeito é acompanhado por uma diminuição do raio parafínico da micela (22.5 0.3 Å), em ausência de fármaco, para 20.0 0.5 em presença de 10 mM de fármaco. Em paralelo, realizamos medidas de EPR (Ressonância Paramagnética eletrônica) destes sistemas. Combinando os resultados de SAXS e de EPR, propusemos um sítio para a localização destes compostos nas micelas de LPC, que seria na interface polar/apolar da mesma. Em um segundo momento, utilizamos as técnicas de SAXS e de EPR para investigar as características estruturais dos agregados formados por TFP e CPZ (a 20 e 60 mM, a pH 4.0 e 7.0). As curvas de SAXS são compatíveis com o espalhamento de agregados pequenos com diferentes geometrias: elipsoidal, cilíndrico e tipo-paralelepípedo. Devido à resolução da técnica, dentro do intervalo de vetores de espalhamento utilizada (até cerca de 0.3 Å-1), não é possível determinar, de forma absoluta, a correta geometria dos agregados, ou seja, todas as geometrias citadas acima ajustam de forma satisfatória as curvas de SAXS. As análises dessas curvas também não excluem a possibilidade de que estes fármacos mantenham-se como nano-cristais em solução (compostos por cerca de 10 celas unitárias, empilhadas na direção-z), seguindo sua estrutura cristalográfica. Medidas de EPR indicam que os auto-agregados a pH 4.0 possuem características semelhantes às micelas, mas a pH 6.5 este efeito não foi evidenciado, uma vez que ocorre uma forte interação entre a sonda e os agregados. Este fato indica que os agregados, a pH 6.5, têm um maior empacotamento, em comparação aos sistemas a pH 4.0. Por fim, utilizamos a Albumina de Soro Bovina (BSA, a 10 50 mg/ml), em diferentes pHs (2.0 9.0), para investigar os efeitos de concentração e de pH nos potenciais de interação das macromoléculas em solução. O fator de forma da proteína foi obtido através da estrutura cristalográfica da HSA (Human Serum Albumine, proteína humana homóloga a BSA), enquanto que as interações proteína-proteína foram calculadas através da relação de fechamento RPA (Random Phase Approximation). Nossos dados indicam que a BSA mantém sua estrutura terciária inalterada de pH 4.0 a 9.0, independente de sua concentração. No entanto, a pH 2.0 a proteína sofre um processo de desenovelamento, indicado pelo aumento da dimensão máxima da mesma. Nossos dados dão suporte para concluir que as interações entre as proteínas, a 10 mg/ml, são praticamente desprezíveis, exceto para os sistemas compostos a pH 2.0 (onde a proteína está desenovelada) e a pH 4.0 (onde evidenciamos a presença de interferência atrativa entre as proteínas). Entretanto, a medida em que aumentamos a concentração proteica, uma função de interferência do tipo repulsiva aparece na curvas de SAXS (para os sistemas de pH 4.0 a 9.0). Além disso, no sistema composto por BSA, pH 5.4 e 50 mg/ml, evidenciamos a existência de monômeros e dímeros em solução, provavelmente devido a proximidade do ponto isoelétrico da proteína (entre 4.8 5.6). Este efeito não foi evidenciado para os outros pHs, nesta mesma concentração. A pH 2.0 (25 e 50 mg/ml) evidenciamos uma compactação da proteína, sendo que sua forma é diferente da forma nativa da BSA. Nestas condições, é possível que a proteína tenha alcançado um estado molten globule, como evidenciado em outros trabalhos. Acreditamos que os efeitos de volume excluído são de grande importância para a estabilidade da proteína in vivo. / In this work we study, mainly by means of small angle X-ray scattering (SAXS), the influence of two phenothiazine derivatives on biomimetic systems as well as the self-assembly features. At the same time, the conformational stability of proteins in the presence of denaturant agents (pH and concentration) was evaluated. First of all, the phenothiazine compounds trifluoperazine (TFP) and chlorpromazine (CPZ) with micelles of the zwitterionic surfactant L--lysophosphatidylcholine (LPC), at pHs 4.0 and 7.0, are reported. The SAXS results demonstrate that, upon addition of both phenothiazines, the LPC micelle of prolate ellipsoidal shape changes into a cylindrically shaped micelle, increasing its axial ratio from 1.6 0.1 (in the absence of drug) to 2.5 0.1 (for 5 and 10 mM of phenothiazine). Such an effect is accompanied by a shrinking of the paraffinic shortest semiaxis from 22.5 0.3 to 20.0 0.5 Å. Besides, EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) evidenced a bigger motion immobilization of the nitroxe probe, in the presence of phenothiazines. Our results provide evidence that the positively charged phenothiazine molecule must be accommodated near the hydrophobic/hydrophilic inner micellar interface. Furthermore, SAXS and EPR experiments were carried out to investigate the structure of the self-aggregates of CPZ and TFP, in aqueous solution. SAXS studies (drug solutions of 20 and 60 mM, at pH 4.0 and 7.0) evidenced that several different particle form factors with a homogeneous electron density distribution, in respect to the water environment, could reproduce the scattering curves. Due to the limitation of scattering intensity in the q range above 0.15 Å-1, precise determination of the aggregate shape was not possible and all of the tested models for ellipsoids, cylinders, or parallelepipeds fitted the experimental data equally well. The SAXS data allows inferring, however, that CPZ molecules might self-assemble in a basis set of an orthorhombic cell, remaining as nanocrystallites in solution. Such nanocrystals are composed of a small number of unit cells (up to 10, in c-direction), with CPZ aggregation numbers of 60-80. EPR spectra of 5- and 16-doxyl stearic acids bound to the aggregates were also performed, indicating a micelle-like aggregate at pH 4.0, and a significant motional restriction of the nitroxide was observed at pH 6.5. This implies that the aggregate is densely packed at this pH and that the nitroxide is tightly bound to it producing a strongly immobilized EPR spectrum. Finally, the effect of concentration and pH on the protein-protein interactions of BSA (Bovine Serum Albumin, from 10 up to 50 mg/ml) was evaluated by SAXS. Our results give support to infer that BSA keeps its native shape (similar to the Human Serum Albumin, HSA, crystallographic structure) unaltered at middle-acid (pH 4.0) up to basic pHs (9.0). At pH 2.0, however, BSA undergoes an unfolding process, indicated by a non globular shape. The protein-protein interactions were analysed into the Random Phase Approximation. The results show that at smaller amounts of BSA (10 mg/ml) the interference effects are not significative over the SAXS curve for pH 5.4 up to 9.0. At pH 4.0 and 10 mg/ml, however, an attractive potential takes place over the SAXS curves, that becomes repulsive with increasing BSA concentration. Besides, at pH 5.4 and 50 mg/ml, we evidenced a dimer-monomer co-existence in the solution. At pH 2.0 and 25 and 50 mg/ml, BSA undergoes to a compact conformation. Probably, BSA is in a molten globule state. Our results give also support to infer that probably, the exclude volume effect plays an important role on the protein stability in vivo.