Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

Orchids are characterized by producing minute endosperm-lacking seeds, which depend on mycorrhizal fungi for germination and embryo development. Some aclorophyllous orchids remain dependent on the mycorrhizal association for carbon acquisition during their whole life history, whereasother orchids develop photosynthesis. Despite the biological significance of orchid mycorrhiza, gene expression studies are lacking. We have used different highthroughput approaches in order to understanding the mechanisms regulating orchid mycorrhiza development and functioning. Firstly, we have used a 2D-LC-MS/MS approach coupled to isobaric tagging for relative and absolute quantification (iTRAQ) to identify proteins with differential accumulation in Oncidium sphacelatum at different stages of mycorrhizal protocorm development (achlorophyllous and green protocorms) after seed inoculation with a Ceratobasidium sp. isolate. Quantitative analysis showed that the expected changes in carbon metabolism in green protocorms were accompanied by enhanced accumulation of proteins involved in the modulation of reactive oxygen species homeostasis, defense related responses, phytoalexins and carotenoid biosynthesis, suggesting that orchid protocorms undergo profound metabolic changes during the switch from the fully mycoheterotrophic to the photosynthethic stage. Secondly, three different proteomic techniques were carried out in independent experiments aiming to identify changes in protein accumulation in mycorrhizal roots of the terrestrial orchid Oeceoclades maculata.Finally, O. maculatamycorrhizal roots were used for transcriptome analyses. The data revealed a strong increase in general stress responses, accompanied by changes in signaling pathways possibly related to fungal recognition and establishment of a compatible interaction. Some of the upregulated genes may be involved in the reorganization of cell structure, likely related to accommodation of the fungal symbiont in the plant roots. We have also observed in mycorrhizal roots up-regulation of genes involved in carbon metabolism, including glycolysis/gluconeogenesis and amino sugars metabolism, as well as genes involved innitrogen assimilation. The down-regulation of genes involved in the jasmonate and ABA transduction pathways, and key genes encoding anti-fungal proteins, such as chitinase and a mannose-specific binding lectin, strongly suggests an alleviation of plant defense responses in O. maculata mycorrhizal roots. In general, our data suggest that the physiology of an orchid mycorrhiza is more similar to a compatible interaction than to an arm-race between plant and fungi. Overall orchid mycorrhiza have proved to be a promising model for investigating plantfungal interactions and further studies should now address the specific roles of the genes showing differential regulation in this study. / As orquídeas são caracterizadas por produzirem sementes diminutas, que não possuem endosperma. Necessitam, portanto, da interação com fungos micorrízicos para germinação e desenvolvimento do embrião. Algumas orquídeas aclorofiladas se mantêm dependentes dos fungos micorrízicos para a aquisição de carbono, enquanto outras desenvolvem a maquinaria fotossintética. Apesar do significado biológico das micorrizas de orquídeas, alterações na expressão gênica e no acúmulo de proteínas foram altamente negligenciads nos últimos anos. Neste trabalho, foram utilizadas diferentes técnicas sequenciamento e identificação de genes e proteínas em larga-escala para acessar as alterações moleculares responsáveis pela regulação das micorrizas de orquídeas. Uma abordagem baseada em 2D-LC MS/MS acoplada a técnica de quantificação absoluta e relativa iTRAQ, foiutilizada para identificar proteínas com acúmulo diferencial em Oncidium sphacelatum em diferentes estágios do desenvolvimento do protocormo (protocormos aclorofilados versus protocormos fotossintetizantes), após inoculação com um fungo do gênero Ceratobasidium. As análises mostraram que, as alterações esperadas no metabolismo do carbono foram acompanhadas de um acúmulo aumentado de proteínas envolvidas na modulação de espécies reativas de oxigênio, respostas de defesa, biossíntese de fitoalexinas e carotenóides, sugerindo que os protocormos de orquídeas passam por profundas alterações metabolicas durante a transição do metabolismo micoheterotrófico para o fotossintético. Posteriormente foram utilizadas três diferentes técnicas de proteômica quantitativa para explorar alterações fisiológicas em raízes micorrizadas e não-micorrizadas de Oeceoclades maculata.Este estudo foi ampliado, pela utilização de uma abordagem transcritômica ao mesmo modelo biológico. Em conjunto, os dados revelaram um forte aumento em respostas relacionadas ao estresse, acompanhadas de alterações em vias de transdução de sinal possivelmente relacionadas ao reconhecimento do simbionte fúngico e estabelecimento de uma interação compatível. Alguns genes com expressão aumentada devem estar envolvidos na reorganização celular, provavelmente ligada a acomodação do simbionte fúngico nas raízes das plantas. Também foi observado o aumento de genes envolvidos no metabolismo do carbono e de açúcares aminados, juntamente a genes relacionados a assimilação de nitrogênio em raízes micorrizadas. A expressão diminuída de genes envolvidas nas vias do jasmonato e ácido abscícico, juntamente a genes-chave que codificam para proteínas anti-fúngicas sugerem fortemente uma atenuação das respostas de defesa da planta em raízes micorrizadas de Oeceoclades maculata. No geral, parece que as micorrizas de orquídeas são fisiológicamente mais próximas de uma simbiose compatível do que de uma interação unilateral em favor da planta. Sobretudo, este sistema biológico provou ser promissor para investigação de interações planta-fungo e, próximas pesquisas devem agora ser focadas em funções específicas dos genes que mostraram regulação diferencial neste estudo.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas e que podem colonizar endofiticamente a planta. Algumas espécies deste gênero são capazes de promover o crescimento vegetal e reduzir o ataque de fitopatógenos. A linhagem de M. mesophilicum SR1.6/6 foi isolada de ramos de citros e devido a sua interação com a planta hospedeira e com patógenos associados a planta, tem sido foco vários trabalhos. Os sistemas de secreção e as bombas de efluxo podem estar envolvidos na modulação das interações de bactérias endofíticas com seus ambientes. Assim, neste estudo foi analisada a composição dos exsudatos produzidos pelas plantas de milho e citros na interação com a SR1.6/6 por GC-MS, foi realizada a reanotação de genes relacionados ao sistema de secreção e bombas de efluxo e foi avaliada a expressão de alguns genes destes sistemas na interação com Zea mays e Citrus sinensis por qPCR. Foram encontrados sistemas de secreção tipo I, II e V, vias SEC e TAT e bombas de efluxo, principalmente super-expressos durante a interação com a planta hospedeira. / Methylobacterium genus is composed by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Some species of this genus are able to promote plant growth and reduce the incidence of pathogens. The SR1.6/6 strain of Methylobacterium mesophilicum is a bacterium isolated from citrus and due to its interaction with the plant has been the focus of several studies. Multidrug efflux pumps and secretion system can be involved modulating the interactions of bacteria with their environments. In this work was analised the root exsudates composition from two host plants citrus and corn interacting with SR1.6/6 by GC-MS technique, additionally was searched and reannotated genes related to secretion system and some multidrug efflux pumps and finally evaluated the gene expression of some of this genes during the interaction with Zea mays and Citrus sinensis by qPCR. Type I, II and V secretion system, SEC and TAT pathway and some multidrug efllux pumps were found in this strain according gene expression. This systems were up-regulated mainly during interaction with host plant.

O gênero Methylobacterium é composto por bactérias de coloração rósea, metilotróficas e que podem colonizar endofiticamente a planta. Algumas espécies deste gênero são capazes de promover o crescimento vegetal e reduzir o ataque de fitopatógenos. A linhagem de M. mesophilicum SR1.6/6 foi isolada de ramos de citros e devido a sua interação com a planta hospedeira e com patógenos associados a planta, tem sido foco vários trabalhos. Os sistemas de secreção e as bombas de efluxo podem estar envolvidos na modulação das interações de bactérias endofíticas com seus ambientes. Assim, neste estudo foi analisada a composição dos exsudatos produzidos pelas plantas de milho e citros na interação com a SR1.6/6 por GC-MS, foi realizada a reanotação de genes relacionados ao sistema de secreção e bombas de efluxo e foi avaliada a expressão de alguns genes destes sistemas na interação com Zea mays e Citrus sinensis por qPCR. Foram encontrados sistemas de secreção tipo I, II e V, vias SEC e TAT e bombas de efluxo, principalmente super-expressos durante a interação com a planta hospedeira. / Methylobacterium genus is composed by pink-pigmented facultative methylotrophic bacteria. Some species of this genus are able to promote plant growth and reduce the incidence of pathogens. The SR1.6/6 strain of Methylobacterium mesophilicum is a bacterium isolated from citrus and due to its interaction with the plant has been the focus of several studies. Multidrug efflux pumps and secretion system can be involved modulating the interactions of bacteria with their environments. In this work was analised the root exsudates composition from two host plants citrus and corn interacting with SR1.6/6 by GC-MS technique, additionally was searched and reannotated genes related to secretion system and some multidrug efflux pumps and finally evaluated the gene expression of some of this genes during the interaction with Zea mays and Citrus sinensis by qPCR. Type I, II and V secretion system, SEC and TAT pathway and some multidrug efllux pumps were found in this strain according gene expression. This systems were up-regulated mainly during interaction with host plant.