Ácidos graxos são moléculas hidrofóbicas essenciais para a composição da estrutura física celular, para o metabolismo energético dos seres vivos e também para os caminhos de sinalização molecular no proteoma celular. No caso de deficiência no ácido graxo docosahexaenóico (DHA) e do ácido eicosapentaenoico (EPA) temos a depressão e a mudança do comportamento. O transporte destas moléculas hidrofóbicas no citosol celular é realizado por uma família de proteínas capazes de se ligar a esses ácidos graxos de maneira seletiva, com alta afinidade e de forma reversível. Esta família de proteína é conhecida como FABP, ou proteínas ligantes de ácido graxo. Para realizar esta função, as FABP possuem características únicas tanto na sua estrutura tridimensional quanto na dinâmica experimentada pelos vários elementos estruturais. Diversos trabalhos identificaram regiões relevantes e, com mutações realizadas em resíduos específicos, caracterizaram o mecanismo como a proteína interage com ligantes e com a bicamada lipídica para a realização da sua função, identificando um processo multi-estágio na interação com a bicamada lipídica. Contudo, a não realização de mutações em todos os resíduos da proteína pode deixar não-identificados regiões ou resíduos da proteína também envolvidos na sua função. Além disso, nunca foi caracterizado o que ocorre com os resíduos e com a estrutura da FABP quando a proteína está complexada com uma bicamada lipídica. No presente trabalho, escolhemos a B-FABP para estudar a interação com ligantes e o complexo proteína-membrana desta família de proteínas. Para isto, as técnicas de ressonância magnética nuclear 15N-HSQC e eletrônica (RMN e RPE) foram utilizadas para acompanhar mudanças estruturais e dinâmicas ocorridas quanto de interações moleculares. Com a técnica de RPE e o uso de derivados de ácidos graxos marcados com radicais nitróxidos, monitoramos o sítio de ligação da molécula de ácido graxo e suas alterações quando na presença do surfactante SDS. No caso de RMN, foi usada em proteínas marcadas isotopicamente com 15N na presença de bicelas isotrópicas de DMPC: DHPC na razão igual a um (q = 1), em uma concentração lipídica (CL) de 4%. Nossos resultados além de identificar os mesmos resíduos já conhecidos na interação da FABP com modelos de membrana, também encontrou novos resíduos nunca antes associados à superfície de contato da FABP com a bicamada lipídica. / Fatty acids are hydrophobic molecules essential to the cell structure, to the energetic metabolism of living organisms and to the molecular signaling pathways in the cell proteome. Depression and behavior alteations are two common consequences of deficiencies in docosahexanoic (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) acids. The transport of such hydrophobic molecules in the cytosol is the main function of a family of proteins capable of making a selective, high affinity, and reversible binding of fatty acids. This family of proteins is known as FABPs (fatty acid binding proteins). To perform their function, FABPs have unique features in both their tridimensional structure and in the dynamics experienced by the several structural elements. Many reports have identified regions that are relevant to function and, through point mutations of specific residues, have characterized the mechanism used by the protein to bind its ligand and also to interact with lipid bilayers. However, the point mutation strategy relies heavily on the choice of residues such that missing residues can lead to the lack of identification of important elements involved in protein function. Moreover, the characterization of the protein-bilayer complex still deserves a more detailed investigation. In this work, we study the B-FABP protein in terms of its interaction with ligands as well as a membrane model system. We made use of magnetic resonance techniques, nuclear (NMR) and electronic (EPR), to probe structural and dynamical changes occurring upon intermolecular interaction. EPR and spin labeled fatty acids allowed us to monitor the ligand binding site in the protein structure and also its alterations in the presence of the surfactant SDS. NMR HSQC was used to gain information on the conformational changes of isotopically labeled protein in the presence of biceles made of DMPC:DHPC (q = 1 and lipid concentration CL of 4%). Our results confirmed relevant functional residues that had been previously identified and also pointed to new residues that had not been implicated as part of the contact surface before, thus widening our understanding of FABP-bilayer interaction.

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

Ácidos graxos são moléculas hidrofóbicas essenciais para a composição da estrutura física celular, para o metabolismo energético dos seres vivos e também para os caminhos de sinalização molecular no proteoma celular. No caso de deficiência no ácido graxo docosahexaenóico (DHA) e do ácido eicosapentaenoico (EPA) temos a depressão e a mudança do comportamento. O transporte destas moléculas hidrofóbicas no citosol celular é realizado por uma família de proteínas capazes de se ligar a esses ácidos graxos de maneira seletiva, com alta afinidade e de forma reversível. Esta família de proteína é conhecida como FABP, ou proteínas ligantes de ácido graxo. Para realizar esta função, as FABP possuem características únicas tanto na sua estrutura tridimensional quanto na dinâmica experimentada pelos vários elementos estruturais. Diversos trabalhos identificaram regiões relevantes e, com mutações realizadas em resíduos específicos, caracterizaram o mecanismo como a proteína interage com ligantes e com a bicamada lipídica para a realização da sua função, identificando um processo multi-estágio na interação com a bicamada lipídica. Contudo, a não realização de mutações em todos os resíduos da proteína pode deixar não-identificados regiões ou resíduos da proteína também envolvidos na sua função. Além disso, nunca foi caracterizado o que ocorre com os resíduos e com a estrutura da FABP quando a proteína está complexada com uma bicamada lipídica. No presente trabalho, escolhemos a B-FABP para estudar a interação com ligantes e o complexo proteína-membrana desta família de proteínas. Para isto, as técnicas de ressonância magnética nuclear 15N-HSQC e eletrônica (RMN e RPE) foram utilizadas para acompanhar mudanças estruturais e dinâmicas ocorridas quanto de interações moleculares. Com a técnica de RPE e o uso de derivados de ácidos graxos marcados com radicais nitróxidos, monitoramos o sítio de ligação da molécula de ácido graxo e suas alterações quando na presença do surfactante SDS. No caso de RMN, foi usada em proteínas marcadas isotopicamente com 15N na presença de bicelas isotrópicas de DMPC: DHPC na razão igual a um (q = 1), em uma concentração lipídica (CL) de 4%. Nossos resultados além de identificar os mesmos resíduos já conhecidos na interação da FABP com modelos de membrana, também encontrou novos resíduos nunca antes associados à superfície de contato da FABP com a bicamada lipídica. / Fatty acids are hydrophobic molecules essential to the cell structure, to the energetic metabolism of living organisms and to the molecular signaling pathways in the cell proteome. Depression and behavior alteations are two common consequences of deficiencies in docosahexanoic (DHA) and eicosapentaenoic (EPA) acids. The transport of such hydrophobic molecules in the cytosol is the main function of a family of proteins capable of making a selective, high affinity, and reversible binding of fatty acids. This family of proteins is known as FABPs (fatty acid binding proteins). To perform their function, FABPs have unique features in both their tridimensional structure and in the dynamics experienced by the several structural elements. Many reports have identified regions that are relevant to function and, through point mutations of specific residues, have characterized the mechanism used by the protein to bind its ligand and also to interact with lipid bilayers. However, the point mutation strategy relies heavily on the choice of residues such that missing residues can lead to the lack of identification of important elements involved in protein function. Moreover, the characterization of the protein-bilayer complex still deserves a more detailed investigation. In this work, we study the B-FABP protein in terms of its interaction with ligands as well as a membrane model system. We made use of magnetic resonance techniques, nuclear (NMR) and electronic (EPR), to probe structural and dynamical changes occurring upon intermolecular interaction. EPR and spin labeled fatty acids allowed us to monitor the ligand binding site in the protein structure and also its alterations in the presence of the surfactant SDS. NMR HSQC was used to gain information on the conformational changes of isotopically labeled protein in the presence of biceles made of DMPC:DHPC (q = 1 and lipid concentration CL of 4%). Our results confirmed relevant functional residues that had been previously identified and also pointed to new residues that had not been implicated as part of the contact surface before, thus widening our understanding of FABP-bilayer interaction.