As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).

As enzimas diidroorotato desidrogenases (DHODHs) são flavo-enzimas que catalisam a oxidação do diidroorotato em orotato na quarta etapa da biossíntese de novo de nucleotídeos de pirimidina. Durante a rápida proliferação celular em mamíferos, a via de salvação de pirimidinas é insuficiente para suprir deficiências na síntese de nucleotídeos. Além disso, certos parasitas não possuem a via de salvação e contam somente com a biossíntese de novo para a produção de nucleotídeos. Por esta razão, DHODH se tornou um excelente alvo na busca por inibidores que interrompam a síntese de nucleotídeos. As enzimas DHODHs de E. coli (EcDHODH) e de X. fastidiosa (XfDHODH) são membros da classe 2 das DHODHs e encontram-se associadas à membrana citoplasmática através de uma extensão em seu N-terminal, enquanto que DHODH de T. cruzi (TcDHODH), membro da classe 1 de DHODHs, é uma proteína citosólica. Neste trabalho, usamos uma combinação de metodologias de biologia molecular e bioquímica com técnicas espectroscópicas para obter informações estruturais e funcionais acerca da enzima DHODH. Assim, Ressonância Paramagnética Eletrônica (RPE) associada à marcação de spin sítio dirigida (SDSL) e simulação espectral foram empregadas para estudar a interação da EcDHODH com modelos de membrana. Mudanças na dinâmica estrutural das vesículas induzidas pela enzima foram monitoradas via marcadores de spin localizados em diferentes posições ao longo da cadeia acil de fosfolipídios. Além disso, técnicas de DNA recombinante e mutações sítio dirigidas foram utilizadas para produzir mutantes de EcDHODH no qual um sondas paramagnéticas foram seletivamente ligadas em resíduos localizados na extensão N-terminal da proteína para experimentos subseqüentes de RPE-SDSL. Esses são os primeiros experimentos de marcação de spin sítio dirigida realizados no Brasil e com os quais monitoramos a dinâmica experimentada na região do N-terminal. Além disso, várias tentativas foram feitas para se expressar e purificar a enzima XfDHODH e a estabilidade estrutural da enzima TcDHODH na presença de um de seus inibidores naturais, o orotato, foi monitorada através de experimentos de Dicroísmo Circular (CD). / Dihydroorotate dehydrogenases (DHODHs) are flavin-containing enzymes which catalyse the conversion of (S)-dihydroorotate to orotate, in the fourth step of the de novo biosynthesis of pyrimidine nucleotides. In rapidly proliferating mammalian cells, pyrimidine salvage pathway is insufficient to overcome deficiencies for nucleotide synthesis. Moreover certain parasites lack salvage enzymes, relying solely on the de novo pathway to produce nucleotides. Thus, DHODH has turned out an excellent target to the development of inhibitors that block nucleotide biosynthesis. E. coli DHODH (EcDHODH) and X. fastidiosa DHODH (XfDHODH) are class 2 DHODHs found associated to cytosolic membranes through an N-terminal extension, whereas T. cruzi DHODH (TcDHODH) is a class 1 DHODH localizated in the cytoplasm. In the present work, we used a combination of molecular biology and biochemical methodologies with spectroscopic techniques to obtain structural and functional information on DHODH. On one hand, Electronic Paramagnetic Resonance (EPR) associated with Site-directed Spin Labeling (SDSL) and spectral simulation were employed to study the interaction of EcDHODH with vesicles. Changes in vesicle dynamic structure induced by the enzyme were monitored via spin labels located at different positions along the phospholipid acyl chain and via spin labels located at enzyme specific positions. On the other hand, DNA techniques and site-directed mutagenesis were used to produce mutants of EcDHODH where a nitroxide spin probe was selectively attached to some residues located at the protein N-terminal extension for subsequent EPR-SDSL experiments. These are the first site-directed spin labeling experiments performed in Brazil and the spectra allowed us to monitor dynamics experienced by those residues at the EcDHODH N-terminal domain. Furthermore, molecular biology and biochemical assays were employed with the objective of expressing and purifying XfDHODH and Circular Dichroism (CD) was utilized to probe the structural stability of TcDHODH in the presence of its natural inhibitor (orotate).