La phosphorylation constitue un mécanisme de régulation de la fonction biologique des protéines lié au contrôle des associations inter-moléculaires, de l'activité enzymatique ou de la liaison de ligands. L'isomérisation des liaisons Ser/Thr-Pro après phosphorylation par des kinases spécifiques, souvent impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, se présente comme un nouveau mode de régulation. Ces deux mécanismes de signalisation sont étroitement liés par l'intermédiaire d'enzymes catalysant l'isomérisation cis/trans des prolines au niveau de motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés telles que les peptidyl-prolyl cis/trans isomérases de la famille de Pin1. Elles jouent un rôle cellulaire essentiel mais leur rôle moléculaire exact est encore mal connu. Les interactions moléculaires entre Pin1 et de nombreuses phospho-protéines mitotiques indiquent un rôle dans la régulation du cycle cellulaire et dans l'oncogénèse, et font de Pin1 une cible pharmacologique émergente dans le traitement des cancers. Récemment, des interactions avec la protéine microtubulaire Tau dans sa forme pathologique hyperphosphorylée, au niveau d'un site unique centré autour du motif Thr231-Pro232, pourraient impliquer Pin1 dans la régulation de la liaison de Tau aux microtubules et dans les phénomènes de neurodégénérescence observés dans la maladie d'Alzheimer.<br /><br />Nous avons ciblé les interactions entre Pin1 et la protéine Tau comme modèle de substrats pour une étude détaillée des mécanismes intervenant à l'échelle moléculaire, sur base de substrats peptidiques, qui permettraient d'expliquer le rôle fonctionnel de Pin1. L'interaction avec les substrats au travers des motifs Ser/Thr-Pro phosphorylés est double : un domaine de liaison WW permet la liaison du substrat et un domaine catalytique PPIase (peptidyl-prolyl isomérase) catalyse l'isomérisation cis/trans des prolines. Un criblage par RMN des différents motifs phospho-Ser/Thr-Pro au sein de la protéine Tau a permis de déterminer un nouveau site d'interaction centré autour du motif Thr212-Pro213, phosphorylé uniquement dans la forme pathologique de Tau. <br /><br />Nous avons étendu l'investigation des interactions avec Pin1 à l'échelle de la protéine Tau entière. Comme pour la plupart des régions protéiques impliquées dans les interactions avec Pin1, la protéine Tau se caractérise par une absence de structure globale qui limite considérablement les études par RMN. Un fragment peptidique de 40 acides aminés comprenant les sites Thr231 et Thr212 phosphorylés a permis de montrer un rôle régulateur du domaine WW dans l'activité enzymatique. Une première étude avec une protéine mutante mimant l'état phosphorylé de Tau a montré une interaction avec le domaine catalytique de Pin1 et a nécessité la mise au point préalable d'une technique d'attribution de la protéine Tau par RMN que nous avons appelé « mapping peptidique ».<br /><br />La phosphorylation du domaine WW de Pin1 est associée à l'inhibition de la liaison des substrats et joue un rôle dans la régulation de l'activité de Pin1 in vivo. La forme non phosphorylée active de Pin1 est retrouvée majoritairement dans les cellules cancéreuses et la forme phosphorylée inactive dans les cellules saines. Nous avons envisagé de cibler les interactions entre Pin1 et les phospho-peptides avec la synthèse de molécules organiques mimant le dipeptide phosphoThr-Pro et la mise en œuvre d'un test de criblage par RMN pour l'obtention d'inhibiteurs ciblant le domaine WW de Pin1 qui pourraient mimer la forme inactive de la protéine.

L’imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRI) est une technique d’analyse d’interactions moléculaires présentant de nombreux avantages. Elle peut être appliquée en temps réel et sans marquage, pour étudier un grand nombre d’interactions simultanément sur un même échantillon. La transduction d’un événement d‘interaction entre deux molécules complémentaires en un signal optique, repose sur la perturbation de l’onde plasmonique évanescente créée à la surface d’un film métallique mince.Toutefois, bien que la mesure SPR soit directe et sans marquage, sa spécificité repose entièrement sur celle des molécules sondes déposées à la surface de la puce et donc sur la chimie ayant servi à les immobiliser. Cette limitation devient problématique pour adresser les grands enjeux de santé actuels, liés à la détection de molécules à l’état de traces. En particulier, de nouveaux systèmes d’analyse plus sensibles sont requis pour pouvoir diagnostiquer le cancer au plus tôt, ou encore détecter la présence de contaminants agro-alimentaires en faible concentration.Dans cette perspective d’amélioration de la spécificité de détection, ce travail porte sur la mise au point d’un instrument bimodal couplant la SPRI, capable de quantifier la capture de molécules cibles, à la Spectrométrie Raman Exaltée de Surface (SERS), qui permet d’identifier la nature des molécules capturées en déterminant leur « empreinte » moléculaire. Cette thèse s’inscrit dans un projet ANR regroupant un consortium de partenaires académiques et un industriel.Ce document se concentre sur le développement de l’instrument optique combinant les deux systèmes de détection en un seul prototype. La mesure SPRI est réalisée en configuration Kretschmann, tandis que l’analyse SERS s’effectue par le dessus, en milieu liquide, à travers un hublot. Ces deux mesures simultanées sont rendues possibles grâce à la mise au point d’un substrat métallique nanostructuré. Une caractérisation détaillée du système optique est tout d’abord présentée, puis de premiers résultats de validation de la mesure bimodale sur un cas modèle d’interaction biomoléculaire ADN sont démontrés. Ces expériences prometteuses confirment le fonctionnement de l’instrument bimodal dans la perspective d’applications d’intérêt biologique. / Surface Plasmon Resonance Imaging (SPRI) is a powerful technique to study molecular interactions providing a real time, label free and high throughput analysis. The transduction of an interaction between complementary molecules into an optical signal is based on the perturbation of a plasmonic evanescent wave supported by a thin metallic film.However, despite its direct and label free assets, the specificity of SPR measurements is only guaranteed by the probe molecules grafted on the metallic surface and therefore by the quality of the surface chemistry. This limitation becomes an issue when addressing major health concerns relying on the detection of trace molecules. In particular, new systems are required to help early diagnosis and the control of food contaminants.In view of improving measurement’s specificity, this work reports the development of a bimodal instrument coupling SPRI, allowing the quantification of captured molecules, with Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), adding the precise identification of the molecules by measuring their spectroscopic fingerprint. This PhD is part of an ANR project bringing together academic and industrial partners.This manuscript focuses on the development of the optical instrument combining the two detection systems in a unique prototype. SPRI measurements are performed in the Kretschmann configuration while SERS analysis is implemented from the top, in solution, through a glass window. Nanostructured substrates have been designed and realized to allow the simultaneous experiment.The optical system is described, characterized and validated on the model case of a DNA hybridization. These first results prove the capabilities of the bimodal instrument in the perspective of more complex biological applications.

La spectroscopie UV-Vis résolue en temps a été appliquée à l'étude de différents systèmes moléculaires dont la photophysique est contrôlée par leur interaction avec l’environnement, mais aussi comme outil pour révéler des interactions moléculaires ou des dynamiques structurelles à des échelles de temps comparativement lentes (sec à min.), en utilisant la microfluidique de gouttes pour déclencher une relaxation structurale par des conditions initiales hors équilibre. J'ai appliqué cette approche selon trois axes allant de 1) l'étude approfondie des propriétés émissives des biosenseurs afin de permettre leur utilisation quantitative dans les études d'interactions biomoléculaires, à 2) le développement d'une approche expérimentale originale pour permettre la résolution la cinétique de relaxation structurelle d'une répartition hors équilibre des structures biomoléculaires, et enfin 3) l'application aux biotechnologies à haut débit de la fluorescence résolue en temps pour des analyses d'interactions biomoléculaires précises et rapides, pertinente à la fois pour les domaines académiques et industriels. / In the context of the present thesis, UV-Vis time-resolved spectroscopy was applied targeting the photophysics investigation of different environmentally sensitive molecular systems, but also as a biosensing approach to reveal molecular interactions or structural dynamics on much slower time scales (sec to min), using droplet microfluidics triggering structural relaxation through out-of-equilibrium initial conditions. I thus investigated on a three-axis-target spanning from 1) the in-depth investigation of the emissive properties of biosensors in order to allow their quantitative use in biomolecular interaction studies, to 2) the development of an original experimental approach to enable resolving the structural relaxation kinetics of an out-of-equilibrium distribution of biomolecular structures, and finally 3) the technological application of time resolved fluorescence for precise, rapid, cost effective, biomolecular interaction assays, appealing both for academic and industrial arenas.