Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T02:54:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Copi_Cecilia_M.pdf: 12156283 bytes, checksum: 93ce542963e020dcfb1af6c2bf9d5283 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Durante a gestação normal em primatas e em roedores observa-se o acúmulo de linfócitos natural killer no ambiente uterino (uNK). A funções comprovadas das células uNK estão relaciondas com o reconhecimento das células trofoblásticas alogênicas e produção de citocinas imunomoduladoras do ambiente uterino que garantem o sucesso da gestação. Além da produção de citocinas envolvidas na homeostase do ambiente uterino, as uNK produzem e estocam nos seus grânulos moléculas citotóxicas como a perforina e granzimas. Estas moléculas estão envolvidas na resposta imune inata das células NK, com potencial de promover a lise de células alvo. Porém, se ocorre a ativação desta atividade citolítica, ou mesmo se as uNK promovem a secreção deste arsenal de moléculas citolíticas no ambiente uterino em gestação normal, ou em casos de interrupção da gestação, não são conhecidas. Os conhecimentos nesta área não avançam pelas limitações éticas de estudar experimentalmente o ambiente uterino em gestantes humanos e a falta de modelos experimentais estabelecidos em animais laboratoriais. No presente trabalho, propos-se utilizar o modelo experimental de indução de lesões embrionárias para provocar o desequilíbrio do ambiente uterino e avaliar as alterações nas células uNK. Para tanto, foram utilizados camundongos prenhes no 9° dia de gestação que foram submetidas à procedimentos cirúrgicos de lesão do embrião. Amostras uterinas dos sítios de desenvolvimento embrionários de animais de gestação normal, dos animais com embriões lesionados nos intervalos de 10, 30 e 60 minutos póslesão, e dos animais manipulados cirurgicamente sem a lesão embrionária foram coletados e processados para avaliações através de métodos citoquímicos e imunocitoquímicos em microscopia de luz e eletrônica de transmissão. Os sítios uterinos de embriões lesionados apresentaram reação hiperêmica na região mesometrial já aos 10 minutos pós-lesão, que se acentuava nos períodos mais longos de pós-lesão. As células uNK presentes nesta região apresentaram alteração na reatividade pela citoquimica de lectina DBA e immunocitoquímica com a anti-perforina, sendo evidente a gradual redução na intensidade das reações no decurso do tempo pós-lesão. Na análise ultra-estrutural verificou-se a desestruturação dos grânulos lisossomo-secretores, sendo notória a perda do conteúdo do compartimento secretor evidenciada pela reação com o azul-cuprolínico. O compartimento lisossomal do grânulo embora sofra também uma desestruturação pronunciada, mantêm a reatividade para anti-catepsina D, sugerindo a preservação de parte da sua funcionalidade. A perda do conteúdo do compartimento secretor, notadamente a perforina e os proteoglicanos no período de 10 minutos pós-lesão, sugere a degranulação das uNK e portanto a ativação da atividade citotóxica destas células, numa resposta aguda frente ao desequilíbrio do ambiente uterino afetado pela lesão embrionária. Porém, não foi constatado qualquer indício morfológico da ocorrência da degranulação através do mecanismo exocitose-símile ou ainda, o efeito da ação citolítica sobre as células circunjacentes às uNK ativadas / Abstract: In the uterine environment during normal pregnancy of primates and rodents is seen the accumulation of natural killer lymphocites (uNK). The confirmed functions of uNK cells are related to recognition of allogeneic trophoblast cells and production of immunomodulating cytokines of uterine environment that assure the successful pregnancy. Besides the production of cytokines related to homeostasis of uterine environment, the uNK produce and store citotoxic molecules of perforin and granzymes in their granules. These molecules are involved in the innate immune response of NK cells with potential to promote lysis of target cells. However, whether the lytic activity is triggered or even the uNK promotes the secretion of these sets Df cytolitic molecules into the uterus of normal pregnancy or in the miscarriages are not known. The advances of knowledge in this field are slow down due to ethical limitation of experimental studies with human pregnant uterus and lack of well established experimental models in laboratory animal. In the present work it was proposed to use the experimental model of induction of embryo lesions to promote the unbalance of uterine environment and evaluated the changes in uNK cells. Pregnant mice on 9° gestational day were submitted to surgical procedure of embryo lesion and uterine samples from these embryo lesioned sites were collected after 10, 30 and 60 minutes, as did the normal pregnant and sham operated animais. The samples were processed for cytochemical and immunocytochemical evaluations in light and transmission electron microscopy. The embryo lesioned uterine sites showed hyperemic reaction in the mesometrial region as soon as 10 min after lesion which increased as increased the time lapse after lesion. The uNK cells found in these regions showed reactivity changes with DBA lectin cytochemistry and with anti-perforin immunocytochemistry, being noticed the gradual reduction on reaction intensities on course of time after lesion. In the ultrastructural analysis were seen the disruptions of secretory-Iysosomes granules with notorious lost of secretory compartment contents as were evidenced by cuprolinic blue cytochemical reaction. In spite of structural organization of lysosome compartment of the granules was also affected it was maintained the anti-cathepsin D positive reaction which suggest the preservation of part of its functionality. The secretory compartment contents lost, notably the perforin and proteoglycans at 10 min after embryo lesion suggest degranulations of uNK and therefore an acute response of these cells by activation of citotoxic activity, under effects of unbalance of uterine environment affected by embryo lesion. However, it was not detected any morphological evidence of degranulation by exocytosis-like mechanism or even, the cytolitic effect on neighbor cells around the activated uNK cells / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Aureo Tatsumi Yamada / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T19:21:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Degaki_KarinaYumi_M.pdf: 2877669 bytes, checksum: b1e725db393d6287fab125efb8b00e16 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: As células natural killer uterinas (uNK) atuam na modulação da interface materno-fetal e homeostasia do útero gestante, sem desencadear a atividade citolítica típica de uma resposta imune inata. Contudo, ao provocar uma lesão cirúrgica no embrião (LCE) ocorrem alterações no comportamento das células uNK de camundongos e possível indução da atividade citolítica. O presente trabalho avaliou a expressão gênica de mediadores relacionados tanto com a ativação, quanto efetores da atividade citotóxica das células uNK no útero gestante de camundongos frente à anomalia provocada pela LCE. Foram avaliadas as expressões dos genes perforina, granzima-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L através do RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) semi-quantitativo, a partir do RNAtotal obtido de homogenados teciduais da região mesometrial (RM) dos sítios uterinos de camundongos no 9º dia de gestação normal e grupos de animais submetidos à LCE nos períodos de 0,5, 1, 2, 6, 12 e 24 horas pós-LCM e, de RNA obtido de células uNK isoladas de animais gestantes normais. Foram investigadas também as diferenças nas expressões dos genes DAP12, IFN-??e TNF-a ?em RNA extraídos de células uNK imaturas e maduras microdissecadas de criocortes da RM pela microscopia de captura a laser (LCM) e avaliadas pelo qRT-PCR (quantitative Real Time-PCR). Os resultados do RT-PCR confirmam a expressão de todos os genes avaliados nos homogenados da RM e nas células uNK isoladas não foram detectadas apenas os genes da IL-15 e IL-2. Pela análise semi-quantitativa dos amplicons do RT-PCR os genes das proteínas citolíticas, granzima-A e perforina, juntamente com citocinas pró-inflamatórias IFN- y ?e TNF-a ?apresentaram aumentos significativas em 1h após a LCE e redução para níveis próximos do animal normal nos períodos após 6h da LCE. O aumento na expressão destes genes relacionado com a resposta imune inata das células NK, sugere uma rápida mudança do comportamento das células uNK em resposta à LCE, cujas ativações podem envolver a expressão do gene DAP12 que também mostra tendências de aumento nos mesmos períodos pós-LCE. Por outro lado, a expressão dos genes IL-15, IL-2, IL-18 e IL-6 relacionada com a migração, proliferação e diferenciação das células uNK não teve uma variação significativa entre as amostras de gestação normal e pós-LCE. Do sistema Fas/FasL, a redução significante do FasL resulta na regulação negativa da indução de morte celular por apoptose das células uNK, podendo prolongar a viabilidade destas células no ambiente uterino alterado pela LCE. Estes resultados comprovam que a LCE induz uma rápida regulação positiva da expressão dos genes relacionados com mecanismos de citotoxicidade da resposta imune inata das células uNK. Pelas análises dos genes DAP12, TNF-??e IFN-y ?através do qRT-PCR do RNA extraído de células uNK isoladas pela LCM identificaram-se diferenças nas expressões destes genes entre as células uNK imaturas e maduras classificadas atualmente por critérios morfológicos. As diferenças de expressões comprovam a ocorrência de subpopulações com heterogenidade funcional não atribuível apenas a subtipos de estágios de diferenciação celular e com possíveis domínios de distribuição específica no ambiente uterino / Abstract: The uterine natural killer cells (uNK) actively modulate the maternal-fetal interface and homeostasis of pregnant uterus, without triggering the typical cytolytic activity of innate immune response. However, experimentally induced embryo lesion in the pregnant mouse uterus, changes the uterine homeostasis with commitment of uNK cell and possible induction of its cytolytic activity. The present work evaluated the gene expression of mediators related either to the activation and effectors molecules of uNK cells cytotoxic activity. It was evaluated the genes of perforin, granzyme-A, IFN-y, IL-15, IL-18, TNF-a, IL-6, IL-2, DAP-12, Fas, Fas-L by RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction), using RNA isolated from normal pregnant mice uterus on gestational day (gd) 9 and after 0.5, 1, 2, 6, 12 and 24h of abnormal pregnancy provoked by surgical lesion of the embryo (SLE) and also from RNA obtained from uNK cells isolated from normal pregnant mice. Differences in the DAP12, IFN-??and TNF-a ?genes expressions were also investigated with RNA isolated from immature and mature subtypes of uNK cells dissected from cryosections of mesometrial regions in the laser capture microscope (LCM) and evaluated by quantitative Real Time-PCR (qRT-PCR). The results of RT-PCR confirmed the expression of all genes evaluated in the uterine tissue homogenates and in the uNK cells were not detected the only expression of IL-15 and IL-2 genes. By semi-quantitative analysis of RT-PCR amplicons, the genes of cytolytic proteins, granzymes-A and perforin all together with pro-inflammatory cytokines IFN-y ?and TNF-a ?showed significant increasing at 1h after SLE and decreasing to the level near of normal pregnancy after 6h of SLE. The increasing expression of these genes related to innate immune response of NK cells suggest the quick changes of uNK cells behavior in response to the SLE, which activation could involve the expression of DAP12 gene that also showed increasing at the same period after SLE. On the other hand, the expression of IL-15, IL-2, IL-18 and IL-6 genes related to the migration, proliferation and differentiation of uNK cells did not showed significant differences among the SLE samples and normal pregnancy. The significant decreasing of FasL after SLE could down regulate the triggering of apoptotic cell death pathway in the uNK cells and therefore, increasing the viability of these cells in the uterine microenvironment affected by SLE. These results prove that SLE induces fast up-regulation genes expression related to the cytotoxic pathway of uNK cells innate immune response ability. Based on analysis of qRT-PCR of DAP12, TNF-a ?and IFN-y ?genes performed with RNA obtained from uNK cells dissected in the LCM, it was identified differences in the expression of these genes between now a days classified as immature and mature forms of uNK cells. These expressions differences attest the occurrence of functionally heterogeneous subpopulations of uNK cells not restricted to the differentiation stages and possible specific distribution domains in the uterine environment / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural