Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.