Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em frangos conhecidas como colibacilose. A APEC MT78, ao contrário de outras linhagens APEC, foi capaz de invadir células não-fagocitárias no modelo de fibroblastos aviários (CEC-32). Considerando que as interações patógeno-hospedeiro envolvem modificações na abundância de proteínas e padrões de expressão, principalmente nas proteínas de superfície, nosso objetivo foi comparar o proteoma da MT78 crescida em meio de cultura celular com o proteoma de MT78 isolada de fibroblastos aviários infectados (condição de co-cultura). Desenvolvemos aqui a padronização das etapas de extração de proteínas totais, isolamento de células bacterianas do co-cultivo e análise proteômica de modo a obtermos uma análise proteômica global reprodutível e de qualidade. A análise da interação APEC MT78 e células CEC-32 por microscopia óptica e eletrônica de varredura revelou que essa cepa se associa à célula-alvo em um padrão de adesão localizada. A internalização de APEC MT78 pareceu ocorrer como resultado de uma interação entre bactéria-célula que dispara rearranjos do citoesqueleto de actina da célula-alvo, formando estruturas filo e lamelipodiais que são dependentes da viabilidade bacteriana. O reisolamento de células bacterianas intactas, observadas por microscopia eletrônica de transmissão, após o co-cultivo com CEC-32 foi obtido através da técnica de solubilização diferencial de membranas. As células bacterianas foram sonicadas e as proteínas digeridas em solução seguida de uma etapa de purificação. Nós identificamos 69 proteínas, distribuídas em 9 classes funcionais, incluindo as proteínas de membrana FimA, OmpA and OmpC. A proteína OmpA já foi associada a invasão do patógeno humano NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) à células HBMEC. Esses experimentos representam a primeira investigação proteômica global em E. coli patogênica aviária. As proteínas identificadas representaram diferentes rotas metabólicas, funções fisiológicas e diferentes localizações subcelulares. / In poultry, Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause localized extra- intestinal infections that often become systemic. APEC strain MT78 was able to invade non-phagocytic avian fibroblasts in vitro, raising the possibility that some APEC strains may invade epithelial cells and gain systemic access. Using light microscopy and scanning electron microscopy, we observed that viable MT78 strain associated with CEC-32 fibroblasts cells in clusters, and following association, MT78 internalization appeared to result from cytoskeleton rearrangements, such as filopodia and lamellipodia, in the eukaryotic membrane. Considering that host-pathogen interactions involve modifications of protein abundance and expression, mainly in surface proteins, we compared the proteome of MT78 harvested from culture medium with the proteome of MT78 isolated from infected avian fibroblasts (co-culture condition). For this purpose, we developed standard analytical procedures for global protein extraction and isolation of bacterial cells from infected CEC-32. Judged by transmission electron microscopy, we successfully reisolated intact APEC MT78 cells from CEC-32 fibroblasts using the differential membrane solubilization method. Bacterial cells were then sonicated and proteins digested in solution following a clean up procedure. We identified 69 proteins, distributed in 9 functional classes, including the membrane proteins FimA, OmpA and OmpC. The OmpA protein was already associated to invasion of the human pathogen called NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) to endothelial cell line HBMEC. Our results represent the first global proteomic investigation in APEC. The proteome of MT78 infecting avian fibroblasts may allow us to identify key proteins linked to the successful adhesion and/or invasion of host cells by APEC and thus throw light into the pathogenesis of avian colibacillosis.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em aves, que podem ser localizadas ou sistêmicas, denominadas colibacilose. O patotipo de APEC não está definido, mas vários genes de virulência são associados a essas cepas, como os genes plasmidiais iroN, ompT, hlyF, iss e iutA, propostos, em 2008, como preditores da virulência de APEC. Além dos genes de virulência conhecidos, outros fatores podem estar associados à patogenicidade bacteriana, como as maquinarias de secreção protéica denominadas Sistemas de Secreção. O Sistema de Secreção do Tipo 6 (T6SS), descrito em 2006, tem sido associado à virulência de cepas APEC. Este trabalho divide-se em duas partes: a primeira teve como objetivo avaliar a frequência dos genes iroN, ompT, hlyF, iss e iutA em 401 cepas aviárias de E. coli e sua relação com a patogenicidade in vivo dessas cepas. A segunda parte teve como objetivos verificar a frequência de genes componentes do T6SS (clpV, vgrG, icmF e dotU), em uma coleção de 187 cepas APEC; e, em algumas cepas positivas para os genes, verificar a expressão de um fenótipo relacionado ao sistema, bem como a expressão do efetor vgrG e da ATPase do sistema clpV2, além da secreção de proteínas, no meio de cultura e durante contato com células eucarióticas. Os resultados da primeira parte indicam que cepas com dois ou mais dos genes analisados tem maior probabilidade de serem patogênicas do que cepas com apenas um ou nenhum dos genes. Já os da segunda parte mostram que várias cepas apresentaram duas cópias de pelo menos um dos genes testados, e algumas delas apresentaram resistência à predação por D. discoideum. Não foram encontradas diferenças entre a expressão dos genes vgrG (1 e 2) e clpV2 em cultura pura ou em contato com células eucarióticas. Este trabalho apresenta a triagem de genes plasmidiais em uma grande coleção de amostras de Escherichia coli, e a primeira triagem de genes do T6SS em uma coleção de isolados APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causes extraintestinal infections in birds, which can be localized or systemic, known as colibacillosis. The APEC pathotype is still undefined, but several virulence genes are associated with these strains, as the plasmid-linked genes iroN, ompT, hlyF, iss and iutA, proposed in 2008 as APEC virulence predictors. Besides the known virulence genes, other factors may be associated with bacterial pathogenicity, such as the protein secretion machineries called Secretion Systems. Described in 2006, Type 6 Secretion System (T6SS) has been associated with virulence of APEC strains. This work is divided in two parts: the first aimed to evaluate the frequency of iroN, ompT, hlyF, iss and iutA genes in 401 avian strains of E. coli and its relationship with in vivo pathogenicity of these strains. The second part aimed to verify the frequency of T6SS genes (clpV, vgrG, icmF and dotU) in a collection of 187 APEC strains; and verify, in some positive strains, the expression of a phenotype related to the system, as well as the gene expression of effector vgrG and ATPase clpV2, besides the secretion of proteins into the culture medium and during contact with eukaryotic cells. The results of the first part of this study indicate that isolates harboring two or more of the genes analyzed were most likely to be pathogenic than strains harboring only one or none of the genes. The results of the second part show that several strains harbored two copies of at least one of the genes tested, and some of them were resistant to predation by D. discoideum. No differences were found between the expression of genes vgrG (1 and 2) and clpV2 in pure culture or in contact with eukaryotic cells. This work presents the screening of plasmidial genes in a large collection of Escherichia coli isolates, and the first screening of T6SS genes in a collection of APEC isolates.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em frangos conhecidas como colibacilose. A APEC MT78, ao contrário de outras linhagens APEC, foi capaz de invadir células não-fagocitárias no modelo de fibroblastos aviários (CEC-32). Considerando que as interações patógeno-hospedeiro envolvem modificações na abundância de proteínas e padrões de expressão, principalmente nas proteínas de superfície, nosso objetivo foi comparar o proteoma da MT78 crescida em meio de cultura celular com o proteoma de MT78 isolada de fibroblastos aviários infectados (condição de co-cultura). Desenvolvemos aqui a padronização das etapas de extração de proteínas totais, isolamento de células bacterianas do co-cultivo e análise proteômica de modo a obtermos uma análise proteômica global reprodutível e de qualidade. A análise da interação APEC MT78 e células CEC-32 por microscopia óptica e eletrônica de varredura revelou que essa cepa se associa à célula-alvo em um padrão de adesão localizada. A internalização de APEC MT78 pareceu ocorrer como resultado de uma interação entre bactéria-célula que dispara rearranjos do citoesqueleto de actina da célula-alvo, formando estruturas filo e lamelipodiais que são dependentes da viabilidade bacteriana. O reisolamento de células bacterianas intactas, observadas por microscopia eletrônica de transmissão, após o co-cultivo com CEC-32 foi obtido através da técnica de solubilização diferencial de membranas. As células bacterianas foram sonicadas e as proteínas digeridas em solução seguida de uma etapa de purificação. Nós identificamos 69 proteínas, distribuídas em 9 classes funcionais, incluindo as proteínas de membrana FimA, OmpA and OmpC. A proteína OmpA já foi associada a invasão do patógeno humano NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) à células HBMEC. Esses experimentos representam a primeira investigação proteômica global em E. coli patogênica aviária. As proteínas identificadas representaram diferentes rotas metabólicas, funções fisiológicas e diferentes localizações subcelulares. / In poultry, Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause localized extra- intestinal infections that often become systemic. APEC strain MT78 was able to invade non-phagocytic avian fibroblasts in vitro, raising the possibility that some APEC strains may invade epithelial cells and gain systemic access. Using light microscopy and scanning electron microscopy, we observed that viable MT78 strain associated with CEC-32 fibroblasts cells in clusters, and following association, MT78 internalization appeared to result from cytoskeleton rearrangements, such as filopodia and lamellipodia, in the eukaryotic membrane. Considering that host-pathogen interactions involve modifications of protein abundance and expression, mainly in surface proteins, we compared the proteome of MT78 harvested from culture medium with the proteome of MT78 isolated from infected avian fibroblasts (co-culture condition). For this purpose, we developed standard analytical procedures for global protein extraction and isolation of bacterial cells from infected CEC-32. Judged by transmission electron microscopy, we successfully reisolated intact APEC MT78 cells from CEC-32 fibroblasts using the differential membrane solubilization method. Bacterial cells were then sonicated and proteins digested in solution following a clean up procedure. We identified 69 proteins, distributed in 9 functional classes, including the membrane proteins FimA, OmpA and OmpC. The OmpA protein was already associated to invasion of the human pathogen called NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) to endothelial cell line HBMEC. Our results represent the first global proteomic investigation in APEC. The proteome of MT78 infecting avian fibroblasts may allow us to identify key proteins linked to the successful adhesion and/or invasion of host cells by APEC and thus throw light into the pathogenesis of avian colibacillosis.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em aves, que podem ser localizadas ou sistêmicas, denominadas colibacilose. O patotipo de APEC não está definido, mas vários genes de virulência são associados a essas cepas, como os genes plasmidiais iroN, ompT, hlyF, iss e iutA, propostos, em 2008, como preditores da virulência de APEC. Além dos genes de virulência conhecidos, outros fatores podem estar associados à patogenicidade bacteriana, como as maquinarias de secreção protéica denominadas Sistemas de Secreção. O Sistema de Secreção do Tipo 6 (T6SS), descrito em 2006, tem sido associado à virulência de cepas APEC. Este trabalho divide-se em duas partes: a primeira teve como objetivo avaliar a frequência dos genes iroN, ompT, hlyF, iss e iutA em 401 cepas aviárias de E. coli e sua relação com a patogenicidade in vivo dessas cepas. A segunda parte teve como objetivos verificar a frequência de genes componentes do T6SS (clpV, vgrG, icmF e dotU), em uma coleção de 187 cepas APEC; e, em algumas cepas positivas para os genes, verificar a expressão de um fenótipo relacionado ao sistema, bem como a expressão do efetor vgrG e da ATPase do sistema clpV2, além da secreção de proteínas, no meio de cultura e durante contato com células eucarióticas. Os resultados da primeira parte indicam que cepas com dois ou mais dos genes analisados tem maior probabilidade de serem patogênicas do que cepas com apenas um ou nenhum dos genes. Já os da segunda parte mostram que várias cepas apresentaram duas cópias de pelo menos um dos genes testados, e algumas delas apresentaram resistência à predação por D. discoideum. Não foram encontradas diferenças entre a expressão dos genes vgrG (1 e 2) e clpV2 em cultura pura ou em contato com células eucarióticas. Este trabalho apresenta a triagem de genes plasmidiais em uma grande coleção de amostras de Escherichia coli, e a primeira triagem de genes do T6SS em uma coleção de isolados APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causes extraintestinal infections in birds, which can be localized or systemic, known as colibacillosis. The APEC pathotype is still undefined, but several virulence genes are associated with these strains, as the plasmid-linked genes iroN, ompT, hlyF, iss and iutA, proposed in 2008 as APEC virulence predictors. Besides the known virulence genes, other factors may be associated with bacterial pathogenicity, such as the protein secretion machineries called Secretion Systems. Described in 2006, Type 6 Secretion System (T6SS) has been associated with virulence of APEC strains. This work is divided in two parts: the first aimed to evaluate the frequency of iroN, ompT, hlyF, iss and iutA genes in 401 avian strains of E. coli and its relationship with in vivo pathogenicity of these strains. The second part aimed to verify the frequency of T6SS genes (clpV, vgrG, icmF and dotU) in a collection of 187 APEC strains; and verify, in some positive strains, the expression of a phenotype related to the system, as well as the gene expression of effector vgrG and ATPase clpV2, besides the secretion of proteins into the culture medium and during contact with eukaryotic cells. The results of the first part of this study indicate that isolates harboring two or more of the genes analyzed were most likely to be pathogenic than strains harboring only one or none of the genes. The results of the second part show that several strains harbored two copies of at least one of the genes tested, and some of them were resistant to predation by D. discoideum. No differences were found between the expression of genes vgrG (1 and 2) and clpV2 in pure culture or in contact with eukaryotic cells. This work presents the screening of plasmidial genes in a large collection of Escherichia coli isolates, and the first screening of T6SS genes in a collection of APEC isolates.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em frangos conhecidas como colibacilose. A APEC MT78, ao contrário de outras linhagens APEC, foi capaz de invadir células não-fagocitárias no modelo de fibroblastos aviários (CEC-32). Considerando que as interações patógeno-hospedeiro envolvem modificações na abundância de proteínas e padrões de expressão, principalmente nas proteínas de superfície, nosso objetivo foi comparar o proteoma da MT78 crescida em meio de cultura celular com o proteoma de MT78 isolada de fibroblastos aviários infectados (condição de co-cultura). Desenvolvemos aqui a padronização das etapas de extração de proteínas totais, isolamento de células bacterianas do co-cultivo e análise proteômica de modo a obtermos uma análise proteômica global reprodutível e de qualidade. A análise da interação APEC MT78 e células CEC-32 por microscopia óptica e eletrônica de varredura revelou que essa cepa se associa à célula-alvo em um padrão de adesão localizada. A internalização de APEC MT78 pareceu ocorrer como resultado de uma interação entre bactéria-célula que dispara rearranjos do citoesqueleto de actina da célula-alvo, formando estruturas filo e lamelipodiais que são dependentes da viabilidade bacteriana. O reisolamento de células bacterianas intactas, observadas por microscopia eletrônica de transmissão, após o co-cultivo com CEC-32 foi obtido através da técnica de solubilização diferencial de membranas. As células bacterianas foram sonicadas e as proteínas digeridas em solução seguida de uma etapa de purificação. Nós identificamos 69 proteínas, distribuídas em 9 classes funcionais, incluindo as proteínas de membrana FimA, OmpA and OmpC. A proteína OmpA já foi associada a invasão do patógeno humano NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) à células HBMEC. Esses experimentos representam a primeira investigação proteômica global em E. coli patogênica aviária. As proteínas identificadas representaram diferentes rotas metabólicas, funções fisiológicas e diferentes localizações subcelulares. / In poultry, Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) cause localized extra- intestinal infections that often become systemic. APEC strain MT78 was able to invade non-phagocytic avian fibroblasts in vitro, raising the possibility that some APEC strains may invade epithelial cells and gain systemic access. Using light microscopy and scanning electron microscopy, we observed that viable MT78 strain associated with CEC-32 fibroblasts cells in clusters, and following association, MT78 internalization appeared to result from cytoskeleton rearrangements, such as filopodia and lamellipodia, in the eukaryotic membrane. Considering that host-pathogen interactions involve modifications of protein abundance and expression, mainly in surface proteins, we compared the proteome of MT78 harvested from culture medium with the proteome of MT78 isolated from infected avian fibroblasts (co-culture condition). For this purpose, we developed standard analytical procedures for global protein extraction and isolation of bacterial cells from infected CEC-32. Judged by transmission electron microscopy, we successfully reisolated intact APEC MT78 cells from CEC-32 fibroblasts using the differential membrane solubilization method. Bacterial cells were then sonicated and proteins digested in solution following a clean up procedure. We identified 69 proteins, distributed in 9 functional classes, including the membrane proteins FimA, OmpA and OmpC. The OmpA protein was already associated to invasion of the human pathogen called NMEC (neonatal meningitis-associated E. coli) to endothelial cell line HBMEC. Our results represent the first global proteomic investigation in APEC. The proteome of MT78 infecting avian fibroblasts may allow us to identify key proteins linked to the successful adhesion and/or invasion of host cells by APEC and thus throw light into the pathogenesis of avian colibacillosis.

Escherichia coli patogênicas aviárias (APEC) causam infecções extraintestinais em aves, que podem ser localizadas ou sistêmicas, denominadas colibacilose. O patotipo de APEC não está definido, mas vários genes de virulência são associados a essas cepas, como os genes plasmidiais iroN, ompT, hlyF, iss e iutA, propostos, em 2008, como preditores da virulência de APEC. Além dos genes de virulência conhecidos, outros fatores podem estar associados à patogenicidade bacteriana, como as maquinarias de secreção protéica denominadas Sistemas de Secreção. O Sistema de Secreção do Tipo 6 (T6SS), descrito em 2006, tem sido associado à virulência de cepas APEC. Este trabalho divide-se em duas partes: a primeira teve como objetivo avaliar a frequência dos genes iroN, ompT, hlyF, iss e iutA em 401 cepas aviárias de E. coli e sua relação com a patogenicidade in vivo dessas cepas. A segunda parte teve como objetivos verificar a frequência de genes componentes do T6SS (clpV, vgrG, icmF e dotU), em uma coleção de 187 cepas APEC; e, em algumas cepas positivas para os genes, verificar a expressão de um fenótipo relacionado ao sistema, bem como a expressão do efetor vgrG e da ATPase do sistema clpV2, além da secreção de proteínas, no meio de cultura e durante contato com células eucarióticas. Os resultados da primeira parte indicam que cepas com dois ou mais dos genes analisados tem maior probabilidade de serem patogênicas do que cepas com apenas um ou nenhum dos genes. Já os da segunda parte mostram que várias cepas apresentaram duas cópias de pelo menos um dos genes testados, e algumas delas apresentaram resistência à predação por D. discoideum. Não foram encontradas diferenças entre a expressão dos genes vgrG (1 e 2) e clpV2 em cultura pura ou em contato com células eucarióticas. Este trabalho apresenta a triagem de genes plasmidiais em uma grande coleção de amostras de Escherichia coli, e a primeira triagem de genes do T6SS em uma coleção de isolados APEC. / Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) causes extraintestinal infections in birds, which can be localized or systemic, known as colibacillosis. The APEC pathotype is still undefined, but several virulence genes are associated with these strains, as the plasmid-linked genes iroN, ompT, hlyF, iss and iutA, proposed in 2008 as APEC virulence predictors. Besides the known virulence genes, other factors may be associated with bacterial pathogenicity, such as the protein secretion machineries called Secretion Systems. Described in 2006, Type 6 Secretion System (T6SS) has been associated with virulence of APEC strains. This work is divided in two parts: the first aimed to evaluate the frequency of iroN, ompT, hlyF, iss and iutA genes in 401 avian strains of E. coli and its relationship with in vivo pathogenicity of these strains. The second part aimed to verify the frequency of T6SS genes (clpV, vgrG, icmF and dotU) in a collection of 187 APEC strains; and verify, in some positive strains, the expression of a phenotype related to the system, as well as the gene expression of effector vgrG and ATPase clpV2, besides the secretion of proteins into the culture medium and during contact with eukaryotic cells. The results of the first part of this study indicate that isolates harboring two or more of the genes analyzed were most likely to be pathogenic than strains harboring only one or none of the genes. The results of the second part show that several strains harbored two copies of at least one of the genes tested, and some of them were resistant to predation by D. discoideum. No differences were found between the expression of genes vgrG (1 and 2) and clpV2 in pure culture or in contact with eukaryotic cells. This work presents the screening of plasmidial genes in a large collection of Escherichia coli isolates, and the first screening of T6SS genes in a collection of APEC isolates.

Neste trabalho foi estuda a interação da E. coli patogênica aviária (APEC), agente etiológico da colibacilose aviária, e células não fagocitárias. A APEC é uma ExPEC (E. coli extra-intestinais), grupo que também inclui a UPEC (E. coli uropatogênica) e a NMEC (E. coli de meningite neonatal). Foi analisado o comportamento de 8 cepas APEC - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - frente a duas linhagens de células não-fagocitárias, fibroblastos aviários CEC-32 e células endoteliais humanas EAhy926. Foi realizada a genotipagem de 33 genes associados à virulência, verificou-se capacidade de associação (adesão e invasão), de invasão e de multiplicação intracelular, de citotoxicidade e de ativação das caspases 3/7 das cepas após infecção de fibroblastos aviários. Foi observado que enquanto todas as cepas foram capazes de aderir aos fibroblastos aviários, somente a cepa MT78 foi capaz de invadí-los em níveis comparáveis à bactéria invasiva Salmonella Typhymurium SL1344. As cepas APEC não induziram ativação de capases 3/7, nem foram citotóxicas aos fibroblastos. Uma vez que a cepa invasiva, MT78, e a não invasiva, IMT2470, apresentam genótipos de virulência muito similares, foi realizado o estudo da expressão por RT-PCR dos genes de virulência da bactéria crescida com e sem fibroblastos aviários, por 3 h. Os resultados mostraram a expressão de adesinas, sideróforos e protectinas/estruturas de resistência ao soro para ambas as cepas na ausência e presença de fibroblastos. A análise da expressão dos genes fimH, ompA, ibeA e gimB pela técnica RT-qPCR revelou a repressão do gene fimH na MT78, mas indução do mesmo na IMT2470. Já as invasinas, gimB e ibeA, estavam induzidas em MT78 e reprimidas em IMT2470, enquanto o gene ompA estava sendo expresso em ambas as cepas. A expressão das invasinas gimB e ibeA explica em parte o fenótipo invasivo da MT78. No presente estudo também foi analisado o comportamento das 8 cepas APEC em relação ao perfil de associação, invasão e multiplicação intracelular ao infectarem células EAhy926. As cepas não mostraram capacidade de invadir as células mas apresentaram um nível de associação muito superior ao dos fibroblastos aviários (até 14 vezes superior para algumas cepas). Este trabalho mostrou que o ensaio in vitro com CEC-32 é um modelo adequado para o estudo da interação celular entre APEC e células eucarióticas e agregou mais conhecimento sobre o patotipo. / In this work the interaction between avian pathogenic E. coli (APEC), the etiological agent of avian colibacillosis, and non-phagocytic cells was studied. APEC is an ExPEC (extraintestinal E. coli), a group that also includes UPEC (uropathogenic E. coli) and NMEC (E. coli neonatal meningitis). We analysed the behavior of 8 APEC strains - MT78, IMT2470, A2363, UEL31, UEL13, UEL17, IMT5155, UEL29 - against two non-phagocytic cell lines, avian fibroblasts (CEC-32) and human endothelial cells (Eahy926). Strains were genotyped for 33 virulence associated genes, and investigated the association capacity (adhesion and invasion), the invasion ability, intracellular multiplication, cytotoxicity and activation of caspases 3/7 of the strains after infecting avian fibroblasts. While all strains were able to adhere to avian fibroblasts, only the strain MT78 was able to invade them at levels comparable to the invasive bacterium Salmonella Typhymurium SL1344. APEC strains could not induce activation of caspases 3/7, nor were cytotoxic to fibroblasts. Since the invasive MT78 and the non-invasive IMT2470 strains presented very similar virulence genotypes, the expression of virulence genes of the bacteria grown in the absence and presence of avian fibroblasts by 3 h was analysed by RT-PCR. Results showed the expression of adhesins, siderophores and protectins/serum resistance structures for both strains in the two culture conditions, with and without fibroblasts. Analysis of the expression of fimH, ompA, ibeA and gimB by RT-qPCR revealed the repression of fimH in MT78, but the induction in IMT2470. In relation to ibeA and gimB invasins, they were induced in MT78 but repressed in IMT2470, while the ompA gene was expressed in both strains. The expression of invasins partly explains the invasive phenotype of MT78. It was also analysed the behaviour of the strains in relation to the association profile, invasion and intracellular multiplication when infecting EAhy926 human endothelial cells. The strains showed no ability to invade endothelial cells but showed a high level of association (up to 14 times higher than for fibroblasts cells for some strains). This study showed that the CEC-32 in vitro model is suitable for the study of cellular interaction between APEC and eukaryotic cells, and added more knowledge about the pathotype.

Escherichia coli patogênica aviária (APEC) é o agente etiológico da colibacilose, doença que acomete galinhas, patos, perus e outras aves, principalmente entre a 2ª e a 12ª semana de vida. Existem diversos estudos sobre genes associados à virulência de APEC, mas eles ainda não são capazes de explicar todos os fenótipos de APEC. Portanto, outros genes associados à virulência – ainda não descritos – devem estar presentes em APEC. Para descobrir novos genes associados à virulência em APEC, uma cepa invasiva foi usada para a construção de uma biblioteca de 1.800 mutantes, através da técnica de mutagênese marcada com assinatura, que insere transposons aleatoriamente no genoma da bactéria. Os mutantes foram selecionados em um ensaio de invasão in vitro a fibroblastos aviários da linhagem CEC-32. A sequência dos transposons inseridos nos mutantes permite a identificação daqueles mutantes que não foram capazes de invadir os fibroblastos. Até agora, 11 de 20 pools de 90 mutantes cada foram analisados, e 48 mutantes parecem ter perdido a capacidade invasiva, ou seja, tiveram sua virulência atenuada. Os demais pools já foram selecionados e terão seu DNA analisado. Todos mutantes que possivelmente perderam sua capacidade invasiva serão testados novamente para confirmar seu fenótipo de virulência atenuada. Depois, a região contendo a sequência do transposon será sequenciada para que se descubra qual gene foi interrompido e é essencial para a virulência in vitro de APEC. Essa biblioteca de mutantes também pode ser testada em modelos de seleção in vivo, de modo que é possível identificar, através da análise dos mutantes ausentes na seleção, genes de virulência essenciais para APEC em diferentes condições. / Avian pathogenic E. coli (APEC) is the causative agent of colibacillosis, a disease that affects poultry and other birds, mainly between two and twelve weeks of age. There are many studies about virulence-associated genes in APEC, but they do not fully explain all the APEC phenotypes. Therefore, other virulence-associated genes – not yet described – must be present in APEC strains. In order to find out new virulence genes, we made 1,800 random-transposons mutants of an APEC invasive strain using the signature-tagged mutagenesis method. The mutants were selected using an in vitro invasion assay to fibroblast cells. The sequence of the inserted transposons allows us to identify mutants that have lost the capacity of invade the cells. Until now, we tested eleven out of twenty pools of ninety mutants each, and forty-eight mutants appeared to have lost the invasive capacity. The other nine pools will be analyzed, and all the possible non-invasive mutants will be tested again to confirm the phenotype. Then, they will have the transposon-inserted region sequenced in order to find out which gene has been disrupted and is essential to APEC in vitro invasiveness. The attenuated mutants can also be selected in vivo, so we would identify essential virulence genes to APEC under different conditions.