Synthetic oligonucleotides, which are short strings of DNA or RNA, are a grooving area of importance for the pharmaceutical industry and for companies that manufacture diagnostic components. The manufacturing process of synthetic oligonucleotides involves many complex processes that use separation and purification techniques like ion-exchange chromatography, ion-pair reversed phase chromatography and ultra-performance liquid chromatography. In this study, the focus lies on the purification process, where the main aim is to develop a separation and purification method for modified oligonucleotides that can be applied on different scales, from an analytical to a preparative scale. Three modified oligonucleotides, and one unmodified with 44 bases, provided by Scandinavian Gene Synthesis (Västerås, Sweden), were analysed and purified on an ultra-performance liquid chromatography and on a preparative-system. Several parameters were investigated, e.g. mobile phase composition, gradients and concentration. Practical analysis and purification were made in two scales; analytical and semi-preparative.  The results showed that the samples contained impurities that were hard to separate from the main sample. The scaling-up tests showed that, with increasing concentration, the impurities become more aggregated with the main product. Fraction analysis showed that several pure fractions were collected from the semi-preparative purification, and therefore some amount of pure sample were collected from the semi-preparative run. In conclusion, the method developed in this master thesis worked well as a significant amount of samples were purified in the semi-preparative purification, and the method worked on modified and unmodified oligonucleotides, containing different amount of modifications. / Syntetiska oligonukleotider, vilket är korta strängar av DNA eller RNA, är ett framväxande område i läkemedelsindustrin och för företag som tillverkar diagnostiska komponenter. Tillverkningsprocessen för syntetiska oligonukleotider involverar många komplexa processer som använder separation- och reningstekniker som jonbyteskromatografi, jonparskromatografi och ultra-performance kromatografi. I denna studie ligger fokus på reningsprocessen där det huvudsakliga syftet är att utveckla en separation- och renings metod för modifierade oligonukleotider som kan appliceras på olika skalor – från analytisk till preparativ skala.  Tre modifierade oligonukleotider, samt en omodifierad med 44 baser, tillhandahållet av Scandinavian Gene Synthesis (Västerås, Sverige), analyserades och renades på ett ultra-performance kromatografi system och ett preparativt reningssystem. Flertal parametrar undersöktes, bland annat mobilfasens komposition, gradienter och koncentration. Analys och rening utfördes i två skalor; analytisk och semi-preparativ skala.  Resultatet visade att proverna innehöll föroreningar som var svåra att separera från huvudkomponenten. Uppskalningstesterna visade att föroreningarna blandade sig mer med huvudkomponenten då koncentrationen ökade. Fraktionsanalyser visade att flera rena fraktioner blev ihopsamlade från den semi-preparativa reningen, som därav visade att en betydelsefull mängd rent prov blev renat i den semi-preparativa reningen. Sammanfattningsvis, den metod som utvecklats i denna uppsats fungerade bra då betydelsefulla mängder oligonukleotider kunde renas till olika grad vid den semi-preparativa reningen, samt att metoden fungerade för både modifierade och icke-modifierade oligonukleotider som innehöll olika mängder modifikationer.

In this study, the effects of certain chromatographic conditions on various modified and unmodified oligonucleotides were investigated. At the forefront of this study was the investigation of a new Ion-pair Reversed-phase liquid chromatography (IP-RPLC) method, that had the potential to replace a previously established triethylammonium acetate (TEAA) IP-RPLC method developed for oligonucleotide separations. This method, utilising the counter ion dibutyl amine (DBA) and a Tris-buffer at pH 8, produced promising results indicating that the strong binding strength of DBA creates a hybrid IEX/RPLC separation method – the separation of oligonucleotides is dynamically based on both charge and length. Higher concentrations of DBA appear to produce better results that include improved efficiency, increased retention and even the potential discovery of hidden impurities. In conjugation with Ultra-high-pressure liquid chromatography (UHPLC) systems, sub-2 µm particle columns and gradient optimisations, separations of complex oligonucleotides could be achieved in short analysis times. Furthermore, effective separations at the analytical level can be applied and adapted to larger scale Prep-LC, potentially also improving the purification process of crude oligonucleotide samples. Further development and validation are, however, required for any future work with this method. / I denna studie har effekten av vissa kromatografiska förhållanden på olika modifierade och icke-modifierade oligonukleotider undersökts. I framkanten av denna studie var undersökningen av en ny IP-RPLC metod, vilken har potential att ersätta den tidigare etablerade trietylammonium acetat (TEAA) IP-RPLC metoden, vilken utvecklats för separationen av oligonukleotider. Denna metod, vilken använder dibutylamin (DBA) som motjon och en Tris-buffert vid pH 8, gav lovande resultat vilka indikerar att den starka bindningsstyrkan av DBA skapar en hybrid IEX/RPLC separationsmetod – separationen av oligonkuleotider styrs både av dess laddning och dess längd. Höga koncentrationer av DBA verkade ge bättre resultat som inkluderar hög effektivitet, ökad retention och även den potentiella upptäckten av gömda föroreningar. I samband med UHPLC systemer, kolonner med mindre än 2µm i partikelstorlek och optimiserade gradienter, separationer av komplexa oligonukleotider erhölls på korta analystider. Effektiva separationer vid den analytiska nivån kan appliceras och adapteras till storskalig preparative-LC, med potential att kunna förbättra reningsprocessen för syntetiserade oligonukleotider. Vidare utveckling och validering krävs för framtida användning av denna metod.