Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Persistent Organic Pollutants (POPs) receive this designation because of the time that remain unchanged in the environment. From the 1960s there was already evidence of the presence of these compounds in sediment, breast milk, fish and eggs. The food chain can be considered a source of contamination of humans by these compounds due to bioaccumulation. The fat contained in milk can accumulate POPs, so this matrix has been used as environmental bioindicator. The currently available methods for the determination of these compounds in breast milk involve, in general, multi-step sample preparation and quantification techniques with low selectivity, have high cost and are time consuming. Thus, this study aimed to develop a fast and efficient method based on sample preparation using the QuEChERS method combined Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry with negative chemical ionization (GC-NCI-MS). In this work we optimized the sample preparation step for the determination of 15 POPs in breast milk (Alpha HCH, beta HCH, gamma HCH, hexachlorobenzene, heptachlor, andrin, dieldrin, endrin, 2,4 DDE, DDT, endosulfan alpha, beta endosulfan, endosulfan sulfate and mirex) using 6 mL of sample extracted with 6 mL of acetonitrile. In the partition step was used 2.6 g MgSO4 and 0.6 g of NaCl. The extract clean-up was performed by dispersive solid-phase extraction of 4 mL of extract and 600 mg of MgSO4 and 200 mg of C18. The extract was evaporated in a Turbovap system and redissolved in 200 μL acetonitrile for the determination by GC-NCI-MS. The method was validated showing linearity for the 15 evaluated compounds. Recoveries of the analytes ranged between 62 and 120% with precision within the acceptable range (RSD <19%). The limits of detection for breast milk, in terms of fat percentage, ranged from 0.75 to 7.5 ng g-1 and the method limits of quantification ranged from 2.5 to 25 ng g-1. The method was applied to 20 samples of breast milk from different regions of the Rio Grande do Sul state, of which only 25% were not contaminated by the studied POPs and the others showed values below the LQ. It is important to emphasize that this is an unpublished work in the area of POPs determination in breast milk by GC-NCI-MS, and could be a basis for future works in this area. / Os Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs) recebem essa denominação devido ao tempo que permanecem inalterados no meio ambiente. A partir dos anos 1960 já havia indícios da presença desses compostos em sedimentos, leite materno, peixe e ovos. A cadeia alimentar pode ser considerada uma fonte de contaminação do ser humano por esses compostos devido à bioacumulação. A gordura contida no leite materno pode acumular os POPs, por isso esta matriz vem sendo utilizada como bioindicador ambiental. Os métodos disponíveis atualmente para a determinação desses compostos em leite materno envolvem, em geral, várias etapas de preparo de amostra e quantificação por técnicas pouco seletivas, apresentam alto custo e demanda de tempo. Assim, esse trabalho visou o desenvolvimento de um método rápido e eficiente baseado no preparo de amostra empregando o método QuEChERS combinado a Cromatografia à Gás, acoplada à Espectrometria de Massas com ionização química negativa (GC-NCI-MS). Neste trabalho otimizou-se a etapa de preparo de amostra para a determinação de 15 POPs em leite materno (HCH alfa, HCH beta, HCH gama, hexaclorobenzeno, heptacloro, andrin, dieldrin, endrin, 2,4 DDE, DDT, endosulfan alfa, endosulfan beta, endosulfan sulfato e mirex) utilizando 6 mL de amostra e extração com 6 mL de acetonitrila. Na etapa de partição utilizou-se 2,6 g de MgSO4 e 0,6 g de NaCl. A limpeza do extrato foi realizada por extração em fase sólida dispersiva de 4 mL de extrato e 600 mg de MgSO4 e 200 mg de C18. O extrato foi evaporado em sistema Turbovap e redissolvido em 200 μL de acetonitrila para determinação por GC-(NCI)-MS. O método foi validado apresentando linearidade para os 15 compostos em estudo. As recuperações dos analitos variaram entre 62 e 120%, com valores de precisão dentro da faixa aceitável (RSD < 19%). Os limites de detecção do método para leite materno em termos de percentual de gordura variaram de 0,75 a 7,5 ng g-1e os limites de quantificação do método variaram de 2,5 a 25 ng g-1. O método foi aplicado para 20 amostras de leite materno de diferentes regiões do estado do Rio Grande do Sul, das quais, apenas 25% não apresentaram contaminação pelos POPs estudados e as demais apresentaram valores menores que o LQ. É importante destacar que trata-se de um trabalho inédito na área de determinação de POPs em leite materno empregando GC-NCI-MS, podendo servir de base para trabalhos futuros nessa área.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-&#946;-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17&#945;-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-&#946;-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-&#946;-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 &#181;L of sample.

Pregnenolona (PREG) e 17-alfa-hidroxipregnenolona (17OHPREG) são dois esteroides produzidos pela glândula adrenal e precursores de vários hormônios esteroidais. A dosagem desses compostos tem aplicações clínicas, como o diagnóstico de doenças relacionadas aos corticoesteroides e mineralocorticóides e especialmente na avaliação da atividade da enzima 3-&#946;-hidroxidesidrogenase que é decisiva no diagnóstico de um dos tipos de hiperplasia da glândula adrenal que causa defeitos severos na síntese de esteroides. Métodos cromatográficos associados à espectrometria de massas superaram a especificidade reduzida dos imunoensaios e tem sido crescentemente utilizados na quantificação de esteroides. Os últimos anos tem sido marcados pela hegemonia da cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) em grande parte devido à velocidade e possibilidade da análise direta de vários analitos. Porém, no caso específico dos esteroides de tipo 3-hidroxi-5-eno, que apresentam baixa afinidade protônica e, portanto, baixa eficiência de ionização, são necessárias muitas etapas para a conversão em derivados mais detectáveis. Embora desfavorecida em relação ao LC-MS/MS nos últimos anos, a cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-MS) apresenta várias características favoráveis para a análise de esteroides como a eficiência cromatográfica ainda insuperável. Adicionalmente, a incorporação da espectrometria de massas em tandem ao CG (CG-MS/MS) torna a técnica tão seletiva quanto LC-MS/MS. No presente trabalho, foi desenvolvido um novo método que permite a extração e derivatização simultâneas da PREG e 17OHPREG de amostras de soro tornando o método de preparo da amostra tão simples quanto os descritos para LC-MS/MS. O método de detecção desenvolvido baseado em ionização química no modo negativo obteve a sensibilidade necessária para o diagnóstico da deficiência da enzima 3-beta-hidroxidesidrogenase utilizando apenas 250 &#181:L de amostra. / Pregnenolone (PREG) and 17&#945;-hydroxypregnenolone (17OHPREG) are two steroid precursors produced by the adrenal gland. The quantification of these compounds is essential for the evaluation of 3-&#946;-hidroxidesidrogenase enzyme activity, which promotes the conversion of PREG in 17OHPREG. The 3-&#946:-hidroxidesidrogenase deficiency is a rare but severe type of adrenal hyperplasia that causes serious defects in steroid synthesis. Chromatographic methods coupled to mass spectrometry overcame immunoassays limitations such as reduced specificity, and have been widely used for steroids quantification. Recent years have been marked by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) hegemony due to the speed and possibility to analyze directly several analytes. However, in the case of type 3-hydroxy-5-ene steroids, which have low affinity for protons and, therefore, low ionization efficiency, many steps are required for conversion to detectable products. Notwithstanding, gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) has some favorable features for steroid analysis such as unbeatable chromatographic efficiency. In addition, the incorporation of tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) makes it as selective as LC-MS/MS. In this study, a new method for simultaneous extraction and derivatization of PREG and 17OHPREG from serum was developed. This procedure makes sample preparation for GC-MS/MS as simples as those described for LC-MS/MS. The detection method based on negative mode chemical ionization achieved the sensitivity required for the diagnosis of 3-&#946;-hidroxidesidrogenase defficiency using only 250 &#181;L of sample.