Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des composés ubiquitaires issus de la combustion incomplète de matières organiques. Ils sont à l'origine de pollutions de l'environnement, surtout liées à l'exploitation des produits pétroliers, car ce sont des composés toxiques pour les êtres vivants et pour l'homme en particulier. De nombreuses bactéries capables de dégrader les HAP ont été isolées et étudiées, mais celles qui les dégradent in situ sont mal connues, car moins de 5% des bactéries du sol sont cultivables en laboratoire. Le premier objectif de cette étude était d'identifier les bactéries qui dégradent les HAP dans le sol par des méthodes moléculaires indépendantes de la culture. A cette fin, une stratégie de marquage isotopique in situ a été mise en œuvre qui repose sur l'utilisation du phénanthrène, un HAP à trois cycles, dans lequel l'isotope naturel du carbone a été remplacé par le 13C. Cette molécule a été introduite comme traceur dans des microcosmes contenant du sol provenant d'un bassin de rétention des eaux de ruissellement d'autoroute. Les bactéries ayant incorporé le 13C ont ensuite été identifiées par séquençage des gènes d'ARNr 16S amplifiés à partir de l'ADN marqué extrait du sol. Les résultats montrent que des Betaprotéobactéries peu étudiées à ce jour, appartenant aux genres Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga et Thiobacillus, ainsi que des Rhodocyclaceae, étaient les principaux acteurs de la dégradation du phénanthrène. La prépondérance des Betaprotéobactéries a été établie par des mesures de PCR quantitative. Une analyse dynamique de la diversité bactérienne a montré que celle-ci changeait en fonction de la biodisponibilité du phénanthrène. En outre, la diversité d'arène-dioxygénases impliquées dans la dégradation des HAP a été explorée sur le plan phylogénétique et fonctionnel. Nous avons ainsi détecté des séquences nouvelles, pour la plupart apparentées à des dioxygénases de Sphingomonadales et de Burkholderiales. Grâce à la construction et l'expression d'enzymes hybrides, il a été possible, pour la première fois, d'associer une activité catalytique d'oxydation des HAP à des séquences partielles de gènes, amplifiées à partir de l'ADN du sol. Les résultats obtenus et les outils mis au point dans cette étude pourront servir à développer des méthodes de diagnostic et de suivi de biodégradation de polluants, par exemple dans le cadre d'opérations de bioremédiation de sites pollués par les HAP. / Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are ubiquitous compounds produced by incomplete combustion of organic matter. They are a source of environmental pollution, especially associated to oil product exploitation, and represent a threat for living organisms including human beings because of their toxicity. Many bacteria capable of degrading PAHs have been isolated and studied. However, since less than 5% of soil bacteria can be cultivated in the laboratory, bacterial species able to degrade PAHs in situ have been poorly studied. The first goal of this study was to identify bacteria that degrade PAHs in soil using culture-independent molecular methods. To this end, a strategy known a stable isotope probing has been implemented based on the use of phenanthrene, a three rings PAH, in which the natural isotope of carbon was replaced by 13C. This molecule has been introduced as a tracer in microcosms containing soil from a constructed wetlands collecting contaminated water from highway runoff. Bacteria having incorporated the 13C were then identified by 16S rRNA gene sequence analysis after PCR amplification from labeled genomic DNA extracted from soil. The results show that so far little studied Betaproteobacteria, belonging to the genera Acidovorax, Rhodoferax, Hydrogenophaga and Thiobacillus, as well as Rhodocyclaceae, were the key players in phenanthrene degradation. Predominance of Betaprotéobactéries was established thanks to quantitative PCR measurements. A dynamic analysis of bacterial diversity also showed that the community structure of degraders depended on phenanthrene bioavailability. In addition, the phylogenetic diversity of ring-hydroxylating dioxygenases, enzymes involved in the first step of PAH degradation, has been explored. We detected new sequences, mostly related to dioxygenases from Sphingomonadales and Burkholderiales. For the first time, we were able to associate a catalytic activity for oxidation of PAHs to partial gene sequences amplified from soil DNA, by constructing hybrid enzymes and assaying their activity The results obtained and the tools implemented in this study may be used to develop methods for the diagnostic and monitoring of pollutant biodegradation in processes such as bioremediation of PAHs contaminated sites.

La fixation symbiotique d’N par les légumineuses est très sensible aux ravageurs, provoquant des dommages sur les racines nodulées, avec un impact sur la fixation d’N et la croissance qui demeure mal connu. Nous avons alors analysé la réponse adaptative de la fixation symbiotique et de la croissance du pois Frisson sauvage et 3 de ses mutants hypernodulants P64, P118 et P121, respectivement mutés sur les gènes SYM28, SYM29 et NOD3, à une ablation de la moitié du système racinaire, en fin de phase végétative. La réponse adaptative a été mesurée 8 jours après ablation, dans des conditions d'alimentation en carbone par la photosynthèse variées. A 380 ppm, le mutant P118 a montré la plus faible diminution de l’activité spécifique de fixation (-17%) suite à l’ablation comparé au sauvage et aux 2 autres mutants (-36% à -62%) associé à une accélération chez les mutants P118 et P121 et un maintien (sauvage et P64) de la croissance des nodosités. A 150 ppm, suite à l’ablation, l’activité spécifique de fixation symbiotique par les nodosités a été diminuée (sauvage), maintenue (P64 et P118) ou augmentée (P121), associée à une accélération (sauvage et P121) ou un maintien (P64 et P118) de la croissance des nodosités. A 750 ppm, l’activité spécifique de fixation a diminué suite à l’ablation pour tous les génotypes, associée à un ralentissement (P64), un maintien (P118, sauvage) ou une faible accélération (P121) de la croissance des nodosités. Les résultats montrent une plus grande capacité de la fixation symbiotique des mutants hypernodulants (P118 et P121 essentiellement) à résister au stress provoqué par l’ablation. / Symbiotic N fixation of legumes is very sensitive to environmental stresses, like pea pests damaging nodulated roots. However, the impact on their N uptake capacity and plant growth has not been studied so far.We analyzed the adaptive response symbiotic N2 fixation and plant growth of pea wild type Frisson and hypernodulating mutants P64, P118 and P121 mutated respectively on genes SYM28, SYM29 and NOD3 to root pruning of half the root system at the end of the vegetative stage. The adaptive responses of pea: cv. Frisson and 3 of its hypernodulating mutants were compared under varying carbon supplies from photosynthesis.At 380 ppm, mutant P118 showed the lowest decrease of the specific activity of N fixation (-17%) following root pruning compared to the wild type and the 2 others mutants (-36% to -62%), associated to an acceleration (P118 and P121) and a maintained (wild type and P64) nodule growth. At 150 ppm, following root pruning, specific activity of N fixation of nodules decreased in wild type, was maintained in P64 and P118 and increased in P121. At 750 ppm, specific activity of N fixation of nodules decreased for all genotypes following root pruning, associated to a maintained nodule growth in wild type and P118, a slower growth in P64 and acceleration in P121.Our results showed a greater capacity of hypernodulating mutants P118 and P121 to withstand the stress induced by root pruning of half the root system.