L'acide rétinoïque (AR) régule la myogénèse embryonnaire. Dans le cadre de ce projet de thèse, nous avons d'une part utilisé l'AR pour moduler la myogénèse embryonnaire, dans la perspective d'étudier les conséquences de cette modulation sur le potentiel ultérieur de croissance et identifier les mécanismes moléculaires mobilisés.D'autre part, nous avons étudié la fonction de deux gènes régulés par l'AR et susceptibles de participer au contrôle de la myogénèse embryonnaire.La première partie du travail a été réalisée sur les modèles truite et poisson-zèbre. Nous avons montré que chez la truite comme chez le poisson zèbre, une incubation dans l'AR entrainait une activation de l'expression de Fgf8et de la différenciation des fibres musculaires rapides. Toutefois, chez la truite, nous n'avons pas pu mettre en évidence de régulation des MRF, indiquant qu'une autre voie est utilisée pour activer la myogénèse chez cette espèce.Dans la seconde partie de ce travail, la fonction de deux gènes régulés par l'AR et exprimés dans le mésoderme a été étudiée chez le poisson-zèbre. Le gène vertnin est exprimé essentiellement dans le tailbud. Quand il est inactivé par injection d'un oligo nucléotide morpholino antisens, on observe une altération de la formation des somites (mais pas de modification apparente du processus de segmentation) et une altération de l'intégrité des fibres lentes. Les fibres lentes sont en effet irrégulièrement espacées et les espaces au niveau des myoseptes verticaux peuvent être anormalement larges et les jonctions myotendineuses mal formées. Le gène arrestine β2aest exprimé dans les somites néo-formés puis également dans le mésoderme présomitique et le tailbud. Son inactivation par injection d'OM antisens entraine l'apparition du phénotype U-type et une altération de la morphologie des fibres lentes avec des fibres qui se détachent des jonctions myotendineuses. / Retinoic acid (RA) regulates embryonic myogenesis. During this thesis project, we first used RA to modulate embryonic myogenesis in order to study consequences of this modulation on the future potential for growth and to identify the underlying molecular mechanisms. Second part deals with the characterisation of the function of two genes regulated by the RA which may be involved in the control of embryonic myogenesis.The first part of the work was performed on the trout and zebrafish models. We have shown that in trout as in zebrafish, incubation in RA produced an activation of Fgf8 expression and differentiation of fast muscle fibers.However in trout, we did not observed regulation of MRF expression indicating that an alternative pathway isused to activate myogenesis in this species.In the second part of this work, the function of two genes regulated by the RA and expressed in the mesodermwas studied in zebrafish. The vertnin gene is expressed primarily in the tailbud. When it is inactivated by injection of antisense morpholino oligonucleotide, there is an alteration in the somites morphogenesis (but no apparent change in the process of segmentation) and impairment of the integrity of the slow muscle fibers. Slowfibers are indeed irregularly spaced and the vertical myosepta can be abnormally large. In addition myotendinous junctions display some abnormal branches. The arrestin β 2a gene is expressed in last formed somites and then also in the presomitic mesoderm and the tailbud. Its inactivation by injection of antisense MO leads to the appearance of the U-type phenotype and alteration of the slow muscle fibers morphology which detach frommyotendinous junctions

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s'associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n'est pas connue. C'est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d'en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l'embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L'absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s'opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l'injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires.

La jonction myotendineuse (JMT) est une interface spécialisée dans la transmission des forces entre le muscle et le tendon. Le collagène XXII (COLXXII) est un nouveau composant de cette jonction (Koch et al., 2004). COLXXII fait partie de la sous-famille des FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) qui se caractérisent par leur capacité à s’associer aux collagènes fibrillaires pour former des réseaux protéiques. La fonction de ce nouveau composant de la JMT n’est pas connue. C’est pourquoi nous avons décidé de réaliser une perte de fonction chez le poisson zèbre en utilisant la stratégie anti-sens morpholinos et d’en étudier le phénotype par différentes techniques. Chez l’embryon, le COLXXII est exprimé aux extrémités des fibres musculaires au niveau de leur ancrage sur le myosepte (structure équivalente au tendon des mammifères) pour être déposé à la JMT. Son expression est régulée par des membres de la famille des FGF, probablement FGF8. L’absence de COLXXII conduit à une perte des capacités contractiles du muscle et au détachement et à la rétractation progressive des fibres musculaires, causés par une rupture de la JMT qui s’opère entre la lame basale des fibres musculaires et la matrice tendineuse. Le morphotype induit par l’injection de morpholino COLXXII phénocopie les mutants sapje (mutant dystrophine) et candyfloss (mutation de la chaîne α2 des laminines) indiquant que COLXXII permet un lien structural entre le muscle et le tendon. Nos résultats montrent que COLXXII joue un rôle crucial dans le développement et la fonction de la JMT et représente un nouveau gène candidat pour les dystrophies musculaires. / The myotendinous junction (MTJ) is a specialized structure that transmits muscle contractile forces to tendon. Collagen XXII (COLXXII) is a novel component of MTJ (Koch et al., 2004). It belongs to the FACITs (Fibrils Associated Collagen with Interrupted Triple helix) subset of the collagen superfamily that is characterized by their capacity to mediate protein-protein interactions. The in vivo role of COLXXII has not been elucidated. Therefore, we decided to analyze its function in developing zebrafish using the morpholino-based knock-down strategy. We showed that its transcripts are exclusively expressed at the extremities of muscle fibers close to myoseptal tendons and the protein is deposited at the MTJ. The onset of COLXXII expression depends on FGF signaling, probably FGF8. Using different methods, we showed that loss of COLXXII induces morphofunctional alterations of muscle/tendon development and muscle weakness. Progressive muscle fiber detachment and retraction are observed in morphants that result from MTJ failure occuring at the muscle basement membrane/myosepta extracellular matrix side. The morphotype of the MO22-injected embryos is reminiscent to the sapje (dystrophin mutant) and candyfloss (laminin α2 chain mutation) mutant phenotypes indicating that COLXXII provides a molecular link between muscle and tendons. Our results suggest that COLXXII plays a crucial role in MTJ development and function and represents a novel candidate gene for muscular dystrophies.

Le collagène XXII (COLXXII) a été décrit, en 2004, comme un marqueur des jonctions tissulaires chez la souris. En particulier, la jonction myotendineuse (JMT) est une matrice extracellulaire spécialisée qui assure une liaison structurale entre le muscle squelettique et le tendon et permet la transmission des forces de contraction au squelette. Mon projet de thèse a visé à caractériser le rôle de COLXXII in vivo; le modèle du poisson zèbre a été choisi. Chez le poisson zèbre, col22a1 code pour COLXXII dont l'expression débute dans tout le somite, puis, se restreint progressivement aux extrémités des fibres musculaires au niveau de la JMT, où est déposée la protéine. Utilisant la technique de morpholino-knockdown, nous avons montré que les morphants développent un phénotype dystrophique et que le COLXXII fait très probablement partie du complexe d'ancrage intégrine α7β1. Cependant, compte tenu de la durée d'efficacité réduite des morpholinos, notre étude était limitée. Utilisant la technologie CRISPR-Cas9, nous avons donc généré deux lignées invalidées pour col22a1. L'analyse ultra-structurale des poissons col22a1-/-, de la jeune larve à l'adulte, montre que les interdigitations du sarcolemme, caractéristiques de la JMT, sont pratiquement absentes chez les mutants (comme chez les morphants), pouvant impacter la transmission des forces et/ou l'attachement du muscle aux myoseptes (tendons). De façon intéressante, pour les deux lignées, la même proportion de larves présente un phénotype très sévère entrainant la mort vers 2 semaines post-fécondation (spf). Les autres larves, elles, survivent et ne montrent pas de phénotype global particulier. En revanche, une forte réduction des interdigitations de la JMT est constatée et dans de rares cas, après challenge des poissons, une rupture musculaire est observée. Une première approche de q- PCR par gène candidat a été réalisée et il semble possible que les différences phénotypiques soient liées à des évènements conjoints d'expressivité variable et de compensation génique. Enfin, utilisant un système original de test de nage à contre-courant par palier, j'ai montré que les poissons col22a1-/- âgés de 6 mois ont une capacité de nage très diminuée et consomment d'avantage d'O2 pendant l'effort comparés aux animaux sauvages. L'efficacité du système musculo-squelettique semble donc moindre en l'absence de collagène XXII. Nos résultats devraient permettre de considérer COL22A1 comme un gène candidat pour les cas de dystrophies musculaires dont la cause génétique est non élucidée / The myotendinous junction (MTJ) is a specialized extracellular matrix which allows the transmission of skeletal muscle forces to bones. My thesis project aimed at characterizing the in vivo role of COLXXII using the zebrafish as a model. The zebrafish col22a1 gene encodes COLXXII whose expression begins in the entire somite, and is then restricted gradually at the MTJ, where the protein is deposited. Morphants (Knockdown) develop a dystrophic phenotype and we have demonstrated that COLXXII is likely a member of the integrin a7ß1 anchoring complex. However, because morpholinos are efficient only few days after injection, our study was limited to early stages of zebrafish development. We thus generated two mutant lines (CRISPR-Cas9) invalidated for col22a1. The typical sarcolemmal interdigitations of the MTJ are almost absent in mutants, from larvae to adult (as in morphants), which could impact the force transmission and/or the muscle attachment to myosepta (tendons). In the two mutant lines, the same proportion of larvae displays a severe phenotype leading to fish death 14 days post-fertilization. On the contrary, other larvae survive without any obvious general phenotype. A first candidate genes approach was realized by qPCR and tends to show that the phenotypic differences may be due to both, variable expressivity and genetic compensation. Finally, I have shown that 6 months col22a1-/- fish show a highly decreased swimming capacity and consume more O2 during effort compared to wild type animals. Thus, we conclude that the musculoskeletal system efficiency seems altered in absence of COLXXII. Our results should allow considering COL22A1 as a candidate gene for muscular dystrophies with unclarified genetic cause.