Skin is daily exposed to sun radiation. Among them, UVA reach the basal layer of epidermis composed of keratinocyte stem cells (KSC) and progenitors commonly called transitory amplifying cells (TA). KSC and TA, responsible of the epidermal renewal, are sensitive to genotoxic agents and more particularly to UV. Indeed, KSC, usually quiescent but composing the stem cell pool all lifelong, as well as TA, are specific targets for photocarcinogenesis and photoageing. In this context, the aim of the project was to develop a method able to isolate KSC and TA for characterizing their response to UVA, and in a more industrial objective, to value a photoprotective and/or genoprotective ingredient by investigating their mechanisms of action. A parallel aim was to define culture conditions suitable for maintaining the stemness of KSC in culture, which is quickly lost from their enter into a proliferative state. Thus we showed that adjunction of adipose derived stem cells (ASC) to fibroblasts in dermis of a skin equivalent model (SE) in order to reproduce the physiological environment of KSC, significantly increases the thickness of the epidermis and preserves the keratinocytes from their senescence. ASC act partially via the increase of fibroblasts proliferation in dermis and potentially via a synergic effect of factors secreted by the combination of ASC and fibroblasts. To compare the behavior of KSC to the one of TA, we firstly optimized the rapid adhesion method ; then compared it to the cell sorting by flow cytometry following the alpha6high/CD71low phenotype, which appeared more efficient. Thus, KSC (alpha6high/CD71low) and TA (alpha6high/CD71high) were then irradiated to UVA. KSC showed a photoresistance compared to TA with a better cell viability and a clonogenic potential superior as well as a better ability to reconstruct a pluristratified epidermis in vitro. We also investigated mechanisms of resistance. Our results demonstrate that the induction of the three types of DNA damage immediately induced by UVA is similar in both populations, but that the repair of single strand breaks (SSB) and of thymin dimers (CPDs) is faster for KSC. Finally, PE1, ingredient preselected by Gattefossé was characterized for its photoprotective and genoprotective effect. We showed that PE1 is able to i) preserve capacity of keratinocytes to form holoclones after UVA radiation, ii) decrease DNA damage, notably 8oxoGuanin and CPDs, and iii) improve several repair genes expression and activities. To conclude, this thesis project showed for the first time that KSC are more resistant to UVA radiation than their direct progeny, TA notably via improved DNA repair systems. Moreover, it allowed to identify a plant extract (PE1) able to protect genome of proliferative keratinocytes to UVA radiation / La peau est quotidiennement exposée aux rayons UV du soleil dont les UVA qui atteignent la couche basale de l'épiderme, composée de cellules souches kératinocytaires (KSC) et de cellules progénitrices appelées communément les cellules d'amplification transitoire (TA). Les KSC et TA, responsables du renouvellement de l'épiderme, sont vulnérables à l'action des agents génotoxiques et plus particulièrement aux rayonnements UV. En effet, Les KSC normalement quiescentes mais constituant la réserve de cellules souches tout au long de la vie de l'organisme, comme les TA, sont des cibles préférentielles pour la photocarcingénèse et le photovieillissement cutanés. Dans ce contexte, le but du projet était de développer une méthode capable d'isoler les KSC et les TA afin de caractériser leur réponse biologique vis-à-vis des UVA et dans un objectif plus industriel, de valoriser un actif photoprotecteur et/ou génoprotecteur par l'investigation de ses mécanismes d'action. Un objectif parallèle était de définir des conditions de culture optimales pour garder le phénotype souche des KSC en culture, qui est rapidement perdu dès leur entrée en prolifération. Ainsi, nous avons montré que l'ajout des cellules souches adipeuses (ASC) aux fibroblastes d'une peau reconstruite (PR), pour reproduire l'environnement des KSC, augmente significativement l'épaisseur de l'épiderme et surtout préserve les kératinocytes de leur entrée en sénescence, en partie par l'augmentation de la prolifération des fibroblastes au niveau du derme et potentiellement par un effet synergique des facteurs solubles sécrétés par la combinaison des ASC/fibroblastes. Afin de comparer le comportement des KSC à celui des TA nous avons donc tout d'abord optimisé la méthode d'adhésion rapide, puis l'avons comparée au tri par cytométrie de flux selon le phénotype alpha6high/CD71low, qui s'est avérée plus efficace. Les KSC (alpha6high/CD71low) et les TA (alpha6high/CD71high) ont ensuite été irradiés aux UVA. Les KSC ont montré une photorésistante plus importante que les TA avec une viabilité cellulaire et un potentiel clonogénique supérieurs ainsi qu'une meilleure capacité à reconstruire un épiderme pluristratifié in vitro. Nous avons aussi recherché les mécanismes de résistance. Nos résultats démontrent que l'induction des 3 types de dommages à l'ADN immédiatement après irradiation est identique pour les deux populations mais que la réparation des cassures simple brin (SSB) et des dimères de pyrimidine (CPDs) est plus rapide pour les KSC. Enfin, PE1, actif préselectionné par Gattefossé, a été caractérisé pour son effet photoprotecteur et génoprotecteur. Nous avons montré que PE1 est capable de (i) préserver la capacité des kératinocytes à former des holoclones après irradiation, (ii) diminuer les lésions à l'ADN, notamment la 8oxoGuanine et les CPDs (iii) améliorer l'expression de plusieurs gènes et les activités de réparation de l'ADN. Pour conclure, ce travail de thèse a montré pour la première fois que les KSC (alpha6high/CD71low), sont plus résistantes vis-à-vis des UVA que les TA (alpha6high/CD71high) notamment grâce à des systèmes de réparation de l'ADN plus actifs dans les KSC, et a permis d'identifier un extrait végétal (PE1) capable de protéger le génome des kératinocytes proliférants contre les UVA

La peau et son vieillissement sont un enjeu de santé publique. Les modèles expérimentaux disponibles pour l'étude du vieillissement cutané restent perfectibles. Dans ce contexte, nos objectifs étaient simultanément d'utiliser les modèles de peaux reconstruites (PR) développés dans notre laboratoire afin i) de mieux comprendre les mécanismes du vieillissement cutané, ii) de démontrer l'efficacité et le mécanisme d'action du sélénium comme « anti âge » et enfin iii) de les faire évoluer en utilisant le support poreux ou auto-assemblé avec des fibroblastes du même donneur prélevés à des âges différents. Ainsi, le modèle de PR cultivé sur une longue période a montré une surexpression du microARN miR30-a par RT qPCR dans les PR « âgées » avec une altération de la fonction barrière mesurée par la perte insensible en eau et une perturbation de la différenciation terminale (baisse d'expression de la loricrine et de l'involucrine). Avec le même modèle in vitro, nos résultats démontrent que la supplementation en sélénium retarde la sénescence des kératinocytes souches. Cette efficacité passe non pas par un effet antioxydant comme attendu mais par l'activation de leur adhésion à la lame basale, qui participe à les conserver souche et donc à préserver le renouvellement épidermique. Enfin, nous avons eu la chance exceptionnelle de préparer des PR avec des fibroblastes provenant d'un donneur unique prélevé à 36 et 72 ans. Les résultats immunohistologiques montrent que l'âge induit une augmentation de l'expression de l'élastine et de la fibrilline ainsi que leur co-expression. L'augmentation de LTBP1 et aSMA suggère que cette augmentation inattendue est due à une dérégulation de la voie TGF-ß et une différenciation des fibroblastes en myofibroblastes. En conclusion l'utilisation de différents modèles de PR a permis d'explorer les mécanismes conduisant au vieillissement cutané et de démontrer l'efficacité du sélénium comme anti âge / Skin and its aging is a public health issue. In vitro skin models available for the study aging remain perfectible. In this context, our objectives were simultaneously to use skin equivalent (SE) developed in our laboratory i) to better understand mechanisms of skin aging, ii) to demonstrate the effectiveness of selenium as “anti-aging” and finally iii) to improve SE using the porous or scaffold free model with fibroblasts from the same donor at different ages. Thus, the model of SE mimicking senescence showed an overexpression of microRNA miR30-a by RT qPCR in old SE with an alteration of the barrier function measured by the transepidermal water loss and a deficiency of epidermal terminal differentiation (decreased expression of loricrin and involucrin). With the same SE model, our results demonstrate that selenium supplementation delays the senescence of keratinocytes stem cells. This effectiveness does not involve antioxidant effect as expected but the activation of their adhesion to the basement membrane, which participates in preserving stemness and epidermal renewal. Finally, we had the opportunity to prepare SE with fibroblasts from a single donor at 36 and 72 years old. The histological results show that age induces an increase in the expression of elastin and fibrillin as well as their co-expression. The increase of LTBP1 and aSMA suggests that this unexpected increase is due to deregulation of the TGF-ß pathway and fibroblasts differentiation into myofibroblasts. In conclusion, the use of different models of SE helps us to explore some mechanisms leading to skin aging and to demonstrate the efficacy of selenium as “anti-aging”