Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: In the current study, two isolates showing killer activity against several wine yeast species in a previous study were identified to strain level and found to belong to the yeast species Candida pyralidae. The identified yeast strains and a Kluyveromyces wickerhamii yeast strain used as a control exhibited killer activity against B. bruxellensis known for its spoilage characteristics in red wine, and against several strains of the genus Brettanomyces on white and red grape juice medium. The killer yeasts inhibited neither the growth of S. cerevisiae nor that of the lactic acid bacteria Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum strains. Yeasts are reported to secrete killer toxins, which can play a role in yeast microbial interactions under winemaking conditions. The C. pyralidae strains were found to secrete two novel killer toxins, designated CpKT1 and CpKT2. These killer toxins were stable and active under winemaking conditions, pH 3.5 - 4.5 and temperature ranges between 15 and 25°C. Ethanol and sugar concentrations found during winemaking did not affect the activity and stability of these killer toxins. Although, the killer toxins differed with regards to their biochemical and environmental stability and activity, they were found to have a similar mode of action. The killer toxins induced a fungistatic effect on B. bruxellensis sensitive cells in addition to binding to the cell wall of the sensitive cells, inducing cell surface and plasma membrane damage as did the Kwkt killer toxin secreted by K. wickerhamii. According to the author’s knowledge this is the first report on the identification of novel killer toxins secreted by C. pyralidae strains isolated from a wine environment as well as the identification of the mode of action of killer toxins on B. bruxellensis cells. This indeed provides great research scope in this field. The exoproteomes consisting of the killer toxins Kwkt, CpKT1 and CpKT2 revealed the presence of exo-glucanases and glucosidases, respectively. The enzymes KwExg1 (exoglucanase) and KwSun4 (glucosidase) retrieved from K. wickerhamii’s exoproteome were identified as the potential toxins, but their killer activity could not be confirmed. These findings suggest that hydrolytic enzymes possess killer activity, as previously reported in literature. However, further investigation is needed to identify the killer toxins characterized in this study. / AFRIKAANSE OPSOMMING: In die huidige studie is twee isolate wat in ’n vorige studie “killer” aktiwiteit teenoor verskeie wyngisspesies vertoon het, tot op rasvlak geïdentifiseer en daar is gevind dat hulle aan die gisspesie Candida pyralidae behoort. Die geïdentifiseerde gisrasse en ’n Kluyveromyces wickerhamii gisras wat as kontrole gebruik is, het “killer” aktiwiteit getoon teenoor B. bruxellensis, wat bekend is vir sy bederfkarakter in rooi wyn, en ook teenoor verskeie rasse van die genus Brettanomyces in wit en rooi druiwesapmedium. Die “killer” giste het nie die groei van óf S. cerevisiae óf van die melksuurbakteria Oenococcus oeni en Lactobacillus plantarum-rasse geïnhibeer nie. Giste word berig om “killer” gifstowwe uit te skei, wat ’n rol kan speel in gis mikrobiese interaksies onder wynbereidingstoestande. Die C. pyralidae-rasse is gevind om twee nuwe “killer” gifstowwe af te skei, wat CpKT1 en CpKT2 genoem is. Hierdie “killer” gifstowwe was stabiel en aktief onder wynbereidingstoestande, pH 3.5 - 4.5 en temperatuur tussen 15 en 25°C. Die etanol- en suikerkonsentrasies wat onder wynbereiding voorkom, het nie die aktiwiteit en stabiliteit van hierdie “killer” gifstowwe beïnvloed nie. Hoewel die “killer” gifstowwe met betrekking tot hulle biochemiese en omgewingstabiliteit en aktiwiteit verskil het, is daar gevind dat hulle ’n eenderse modus van aksie het. Die “killer” gifstowwe het ’n fungistatiese effek op B. bruxellensis sensitiewe selle geïnduseer, buiten dat dit aan die selwand van die sensitiewe selle gebind het, en het seloppervlak- en plasma-membraanskade geïnduseer, net soos die Kwkt “killer” gifstof wat deur K. wickerhamii afgeskei is. So ver die skrywer weet, is hierdie die eerste verslag van die identifisering van nuwe “killer” gifstowwe wat deur C. pyralidae rasse afgeskei word wat uit ’n wynomgewing geïsoleer is, asook van die identifikasie van die modus van aksie van “killer” gifstof op B. bruxellensis selle. Dit verbreed dus beslis die navorsingsomvang van hierdie gebied. Die eksoproteome, bestaande uit die “killer” gifstowwe Kwkt, CpKT1 en CpKT2, het die teenwoordigheid van ekso-glukanases en glukosidases onderskeidelik onthul. Die ensieme KwExg1 (eksoglukanase) en KwSun4 (glukosidase) wat vanuit K. wickerhamii se eksoproteoom herwin is, is as die potensiële gifstowwe geïdentifiseer, maar hulle “killer” aktiwiteit kon nie bevestig word nie. Hierdie bevindings suggereer dat hidrolitiese ensieme “killer” aktiwiteit besit, soos voorheen in die literatuur berig is. Verdere ondersoeke word egter benodig om die “killer” gifstowwe wat in hierdie studie gekarakteriseer is, te identifiseer.

Candida dubliniensis é uma espécie descrita como fenotipicamente semelhante a Candida albicans. Desde sua descrição, em 1995, em Dublin, Irlanda, por Sullivan et al, inúmeros relatos sobre esta levedura são encontrados com o objetivo de se conhecer a origem desta espécie, bem como distinguir as semelhanças e diferenças que existem entre elas. Alguns autores têm observado que esta levedura apresenta resistência a alguns antifúngicos, mais utilizados na prática médica, principalmente sob o ponto de vista imunológico, caso dos portadores de HIV. A gênese do processo de infecção se mostra pouco conhecida. A capacidade de adesão a superfície celular e a produção de exoenzimas são fatores determinantes para o desencadeamento da infecção. A susceptibilidade a toxinas Killer necessita ser estudada, pois permite determinar um significante número de tipos sensíveis de cepas de leveduras. Frente ao exposto, buscamos avaliar o comportamento desta espécie por meio da pesquisa de capacidade de adesão, produção de proteinase e fosfolipase, susceptibilidade a toxinas Killer e resistência a antifúngicos. O ensaio de adesão foi fortemente aderente para a amostra padrão ATCC 777, e aderente para os demais isolados. A atividade enzimática para produção de proteinase mostrou-se se fortemente positiva para a amostra padrão ATCC 777, amostra ATCC 778, CD 07 e CD 14 de C dubliniensis. Entre os isolados presuntivos de C dubliniensis 1 (038), positivo e nos demais 013, 058, 096 e 107, não se observou atividade enzimática. Para a produção de fosfolipase não houve um comportamento distinto entre as amostras de C dubliniensis e os isolados presuntivos. Nenhuma amostra deixou de produzir esta enzima. Os testes de sensibilidade das amostras frente às cepas padrão produtoras de toxinas Killer mostraram dois biótipos diferentes. Os mais freqüentes foram 888 e 688 do total dos 9 isolados estudados. O isolado biótipo 688 (ATCC- 777) de C dubliniensis foi sensível a toxina K2. As demais amostras de C dubliniensis, bem como os isolados presuntivos apesar de serem provenientes de indivíduos HIV+ foram resistentes a K2 e à todas as demais toxinas. Em relação à pesquisa de resistência a antifúngicos, as amostras e isolados presuntivos de C. dubliniensis utilizando se o E-test, foram sensíveis a família dos azóis com valores de CIM de 0.002 1.0 mg/ml e para Anfotericina B os valores de CMI estavam entre 0.002- 0.032. As condições desse estudo permitimo-nos comentar que excetuando a amostra padrão ATCC 777 que teve comportamento distinto em relação às demais amostras, identificadas por genotipagem, como C. dubliniensis e isolados presuntivos, todas apresentaram um comportamento semelhante entre si. Estudos com um maior número de amostras de C. dubliniensis e utilizando-se esses testes ainda são necessários para elucidar se realmente existe um comportamento fenotípico diferencial dessa levedura em relação a C. albicans. / Candida dubliniensis is a newly described specie which is closely related phylogenetically to Candida albicans. It was first identified as a new specie by Sullivan et al., in Dublin, Ireland, 1995.Numerous researches are attempting to identify more detailed characteristics of C. dubliniensis and similitudes and differences between the two related species.The resistence of C. dubliniensis to the usual drugs employed to treat candidosis, particularly in human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals has been emphasizely described. The susceptibility to killer toxins may also contribute to explain some aspects of the resistence process in Candidal infection. Other characteristics such as adhesion capability and exoenzymes activity have been studied in comparision with this newer specie.The aim of this study was to evaluate adhesion capability, exoenzymes activity (proteinase and phospholipase), susceptibility to Killer toxins and sensibility to antifungal agents (azoles and amphotericin B) through E-test of 9 Candida dubliniensis isolates from HIV+ individuals.The adhesion test was strongly positive for the strain ATCC 777 and positive for the other strains. Proteinase activity was strongly posive for the strains ATCC 777, ATCC 778, CD 07, and CD 14, positive for the strain 038 and negative for the other. Phospholipase activity revealed strongly positive results for the strains ATCC 777, CD14, 038, 107. The strains ATCC 778, CD 07, 013, 058, and 096 had positive activity and activity was no absent. The Susceptibility to killer toxin showed to different biotypes: 888 and 688. Only the ATCC 777 strain was susceptible to K2 toxin. No strains presented resistance to azoles or amphotericin-B. The results showed MICs ranged between 0.002 1.0 mg/ml e 0.002- 0.032 respectively.

Candida dubliniensis é uma espécie descrita como fenotipicamente semelhante a Candida albicans. Desde sua descrição, em 1995, em Dublin, Irlanda, por Sullivan et al, inúmeros relatos sobre esta levedura são encontrados com o objetivo de se conhecer a origem desta espécie, bem como distinguir as semelhanças e diferenças que existem entre elas. Alguns autores têm observado que esta levedura apresenta resistência a alguns antifúngicos, mais utilizados na prática médica, principalmente sob o ponto de vista imunológico, caso dos portadores de HIV. A gênese do processo de infecção se mostra pouco conhecida. A capacidade de adesão a superfície celular e a produção de exoenzimas são fatores determinantes para o desencadeamento da infecção. A susceptibilidade a toxinas Killer necessita ser estudada, pois permite determinar um significante número de tipos sensíveis de cepas de leveduras. Frente ao exposto, buscamos avaliar o comportamento desta espécie por meio da pesquisa de capacidade de adesão, produção de proteinase e fosfolipase, susceptibilidade a toxinas Killer e resistência a antifúngicos. O ensaio de adesão foi fortemente aderente para a amostra padrão ATCC 777, e aderente para os demais isolados. A atividade enzimática para produção de proteinase mostrou-se se fortemente positiva para a amostra padrão ATCC 777, amostra ATCC 778, CD 07 e CD 14 de C dubliniensis. Entre os isolados presuntivos de C dubliniensis 1 (038), positivo e nos demais 013, 058, 096 e 107, não se observou atividade enzimática. Para a produção de fosfolipase não houve um comportamento distinto entre as amostras de C dubliniensis e os isolados presuntivos. Nenhuma amostra deixou de produzir esta enzima. Os testes de sensibilidade das amostras frente às cepas padrão produtoras de toxinas Killer mostraram dois biótipos diferentes. Os mais freqüentes foram 888 e 688 do total dos 9 isolados estudados. O isolado biótipo 688 (ATCC- 777) de C dubliniensis foi sensível a toxina K2. As demais amostras de C dubliniensis, bem como os isolados presuntivos apesar de serem provenientes de indivíduos HIV+ foram resistentes a K2 e à todas as demais toxinas. Em relação à pesquisa de resistência a antifúngicos, as amostras e isolados presuntivos de C. dubliniensis utilizando se o E-test, foram sensíveis a família dos azóis com valores de CIM de 0.002 1.0 mg/ml e para Anfotericina B os valores de CMI estavam entre 0.002- 0.032. As condições desse estudo permitimo-nos comentar que excetuando a amostra padrão ATCC 777 que teve comportamento distinto em relação às demais amostras, identificadas por genotipagem, como C. dubliniensis e isolados presuntivos, todas apresentaram um comportamento semelhante entre si. Estudos com um maior número de amostras de C. dubliniensis e utilizando-se esses testes ainda são necessários para elucidar se realmente existe um comportamento fenotípico diferencial dessa levedura em relação a C. albicans. / Candida dubliniensis is a newly described specie which is closely related phylogenetically to Candida albicans. It was first identified as a new specie by Sullivan et al., in Dublin, Ireland, 1995.Numerous researches are attempting to identify more detailed characteristics of C. dubliniensis and similitudes and differences between the two related species.The resistence of C. dubliniensis to the usual drugs employed to treat candidosis, particularly in human immunodeficiency virus (HIV) infected individuals has been emphasizely described. The susceptibility to killer toxins may also contribute to explain some aspects of the resistence process in Candidal infection. Other characteristics such as adhesion capability and exoenzymes activity have been studied in comparision with this newer specie.The aim of this study was to evaluate adhesion capability, exoenzymes activity (proteinase and phospholipase), susceptibility to Killer toxins and sensibility to antifungal agents (azoles and amphotericin B) through E-test of 9 Candida dubliniensis isolates from HIV+ individuals.The adhesion test was strongly positive for the strain ATCC 777 and positive for the other strains. Proteinase activity was strongly posive for the strains ATCC 777, ATCC 778, CD 07, and CD 14, positive for the strain 038 and negative for the other. Phospholipase activity revealed strongly positive results for the strains ATCC 777, CD14, 038, 107. The strains ATCC 778, CD 07, 013, 058, and 096 had positive activity and activity was no absent. The Susceptibility to killer toxin showed to different biotypes: 888 and 688. Only the ATCC 777 strain was susceptible to K2 toxin. No strains presented resistance to azoles or amphotericin-B. The results showed MICs ranged between 0.002 1.0 mg/ml e 0.002- 0.032 respectively.