Brettanomyces bruxellensis est un microorganisme qui est considéré comme la cause majeure des défauts microbiologiques du vin. L’importance de cette levure à l’échelle industrielle est liée au fait qu’elle est isolée à partir de substrats différents tels que la bière, le kombucha, les molasses utilisées pour la production de bioéthanol et autres. Ce projet a pour objectif d’étudier la diversité génétique de l’espèce en se basant sur une large population d’isolats provenant de niches écologiques et géographiques variées. Pour ce faire, une méthode de génotypage robuste (analyse microsatellite) a été optimisée et appliquée sur la population, mettant en évidence la coexistence de populations diploïdes et triploïdes à l’échelle globale. Puis, la relation entre regroupement génétique et traits physiologiques a été explorée. Notamment, l'étude de la tolérance aux sulfites a été effectuée sur un sous-ensemble de souches représentatif de la population. Les résultats obtenus mettent en évidence un lien entre groupes génétiques et comportement vis-à-vis des sulfites. Des expériences de compétition en présence de dioxyde de soufre montrent un avantage sélectif des souches tolérantes aux sulfites par rapport aux souches sensibles, suggérant ainsi une adaptation spécifique au principal antiseptique utilisé en œnologie. Ce travail contribue à une meilleure connaissance de cette levure d’altération du vin en termes de diversité génétique et phénotypique et permet d’émettre des hypothèses sur les stratégies évolutives d'adaptation au milieu anthropique de cette espèce modèle non conventionnelle. / Brettanomyces bruxellensis is a microorganism described as the first cause of microbial spoilage of wine. Its industrial relevance is highlighted by the fact that this yeast is isolated from different substrates such as beer, kombucha, bioethanol fermentation molasses and others. This project aims to explore the genetic diversity of the species by studying a large population of isolates from various geographical and ecological niches. For this purpose, a robust genotyping method (microsatellite analysis) was optimized and applied on the population, thus highlighting the coexistence of diploid and triploid populations worldwide. Further, the relation between genotypic clustering and physiological traits was studied. Namely, sulphite tolerance assay was performed on a subset of strains representative of the total population. The results reveal a link between genetic group and growth profile in the presence of sulphur dioxide. Competition experiments in presence of sulphites highlight a selective advantage of sulphite tolerant strains compared to sulphite sensitive ones, thus suggesting a specific adaptation to the main antimicrobial used in winemaking. This work contributes to a deeper understanding of this wine spoilage microorganism in means of genetic and phenotypic diversity and sheds light on putative evolutionary strategies for adaptation to human related environment of this non-conventional model yeast species.

Thesis (PhD)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: In the current study, two isolates showing killer activity against several wine yeast species in a previous study were identified to strain level and found to belong to the yeast species Candida pyralidae. The identified yeast strains and a Kluyveromyces wickerhamii yeast strain used as a control exhibited killer activity against B. bruxellensis known for its spoilage characteristics in red wine, and against several strains of the genus Brettanomyces on white and red grape juice medium. The killer yeasts inhibited neither the growth of S. cerevisiae nor that of the lactic acid bacteria Oenococcus oeni and Lactobacillus plantarum strains. Yeasts are reported to secrete killer toxins, which can play a role in yeast microbial interactions under winemaking conditions. The C. pyralidae strains were found to secrete two novel killer toxins, designated CpKT1 and CpKT2. These killer toxins were stable and active under winemaking conditions, pH 3.5 - 4.5 and temperature ranges between 15 and 25°C. Ethanol and sugar concentrations found during winemaking did not affect the activity and stability of these killer toxins. Although, the killer toxins differed with regards to their biochemical and environmental stability and activity, they were found to have a similar mode of action. The killer toxins induced a fungistatic effect on B. bruxellensis sensitive cells in addition to binding to the cell wall of the sensitive cells, inducing cell surface and plasma membrane damage as did the Kwkt killer toxin secreted by K. wickerhamii. According to the author’s knowledge this is the first report on the identification of novel killer toxins secreted by C. pyralidae strains isolated from a wine environment as well as the identification of the mode of action of killer toxins on B. bruxellensis cells. This indeed provides great research scope in this field. The exoproteomes consisting of the killer toxins Kwkt, CpKT1 and CpKT2 revealed the presence of exo-glucanases and glucosidases, respectively. The enzymes KwExg1 (exoglucanase) and KwSun4 (glucosidase) retrieved from K. wickerhamii’s exoproteome were identified as the potential toxins, but their killer activity could not be confirmed. These findings suggest that hydrolytic enzymes possess killer activity, as previously reported in literature. However, further investigation is needed to identify the killer toxins characterized in this study. / AFRIKAANSE OPSOMMING: In die huidige studie is twee isolate wat in ’n vorige studie “killer” aktiwiteit teenoor verskeie wyngisspesies vertoon het, tot op rasvlak geïdentifiseer en daar is gevind dat hulle aan die gisspesie Candida pyralidae behoort. Die geïdentifiseerde gisrasse en ’n Kluyveromyces wickerhamii gisras wat as kontrole gebruik is, het “killer” aktiwiteit getoon teenoor B. bruxellensis, wat bekend is vir sy bederfkarakter in rooi wyn, en ook teenoor verskeie rasse van die genus Brettanomyces in wit en rooi druiwesapmedium. Die “killer” giste het nie die groei van óf S. cerevisiae óf van die melksuurbakteria Oenococcus oeni en Lactobacillus plantarum-rasse geïnhibeer nie. Giste word berig om “killer” gifstowwe uit te skei, wat ’n rol kan speel in gis mikrobiese interaksies onder wynbereidingstoestande. Die C. pyralidae-rasse is gevind om twee nuwe “killer” gifstowwe af te skei, wat CpKT1 en CpKT2 genoem is. Hierdie “killer” gifstowwe was stabiel en aktief onder wynbereidingstoestande, pH 3.5 - 4.5 en temperatuur tussen 15 en 25°C. Die etanol- en suikerkonsentrasies wat onder wynbereiding voorkom, het nie die aktiwiteit en stabiliteit van hierdie “killer” gifstowwe beïnvloed nie. Hoewel die “killer” gifstowwe met betrekking tot hulle biochemiese en omgewingstabiliteit en aktiwiteit verskil het, is daar gevind dat hulle ’n eenderse modus van aksie het. Die “killer” gifstowwe het ’n fungistatiese effek op B. bruxellensis sensitiewe selle geïnduseer, buiten dat dit aan die selwand van die sensitiewe selle gebind het, en het seloppervlak- en plasma-membraanskade geïnduseer, net soos die Kwkt “killer” gifstof wat deur K. wickerhamii afgeskei is. So ver die skrywer weet, is hierdie die eerste verslag van die identifisering van nuwe “killer” gifstowwe wat deur C. pyralidae rasse afgeskei word wat uit ’n wynomgewing geïsoleer is, asook van die identifikasie van die modus van aksie van “killer” gifstof op B. bruxellensis selle. Dit verbreed dus beslis die navorsingsomvang van hierdie gebied. Die eksoproteome, bestaande uit die “killer” gifstowwe Kwkt, CpKT1 en CpKT2, het die teenwoordigheid van ekso-glukanases en glukosidases onderskeidelik onthul. Die ensieme KwExg1 (eksoglukanase) en KwSun4 (glukosidase) wat vanuit K. wickerhamii se eksoproteoom herwin is, is as die potensiële gifstowwe geïdentifiseer, maar hulle “killer” aktiwiteit kon nie bevestig word nie. Hierdie bevindings suggereer dat hidrolitiese ensieme “killer” aktiwiteit besit, soos voorheen in die literatuur berig is. Verdere ondersoeke word egter benodig om die “killer” gifstowwe wat in hierdie studie gekarakteriseer is, te identifiseer.

Memoria para optar al título profesional de Ingeniero Agrónomo Mención Enología y Vitivinicultura / El propósito del estudio fue evaluar la eliminación de Brettanomyces bruxellensis por medio de aplicaciones de ozono en mezcla gaseosa a presiones de trabajo y tiempos de exposición diferentes. La investigación se realizo con bloques de madera de roble americano en formato viniblock, los cuales fueron inoculados con las dos cepas de Brettanomyces bruxellensis utilizadas a lo largo del ensayo (cepa 1009 y 1451), donde se evaluó la mortalidad a través de un conteo directo en placas Petri post un periodo de incubación. Los mayores promedios de mortalidad obtenidos para la cepa 1009 (100%) fueron aquellos donde los bloques contaminados fueron expuestos a tiempos de 20 minutos de exposición y a una presión de trabajo de 1,8 bares, para ambas mediciones realizadas (efecto superficial y subsuperficial). En el caso de la cepa 1451 los mejores resultados fueron obtenidos al aplicarse las mismas condiciones anteriormente señaladas. La cepa 1009 tuvo una cinética de crecimiento mayor a la presentada en la cepa 1451, donde el número de colonias fue más numerosa, pero con lo que respecta al comportamiento que tuvieron frente al agente sanitizante sus promedios de mortalidad tendieron a igualarse, lo cual nos indica que ambas cepas son igualmente sensibles a las aplicaciones de ozono en mezcla gaseosa. Por lo que se concluye que el ozono es un buen sanitizante para las maderas de guarda ya que bajo ciertas condiciones de trabajo elimina la totalidad de las levaduras presentes, tanto a nivel superficial como bajo la madera, lo cual otorga la completa esterilidad de las maderas de guarda. / The purpose of this study was to evaluate the elimination of Brettanomyces bruxellensis through applications of ozone gas mixture at different pressures of work and exposure times. The research was carried out with blocks of American oak in viniblock format, which were inoculated with two strains of Brettanomyces bruxellensis used along the assay (strain 1009 and 1451), where mortality was evaluated through a direct count in Petri dishes post an incubation period. The highest average mortality obtained for strain 1009 (100%) were those contaminated blocks were exposed to times of 20 minutes of exposure and a working pressure 1.8 bar for both measurements (surface and subsurface effect) in the case of strain 1451 the best results were obtained when applying the same conditions stated above. The 1009 strain had higher growth kinetics to that presented in strain 1451, where the number of colonies was larger, but with regard to behavior which sanitizing agent were compared to averages of mortality tended to level out, which indicates that both strains are equally sensitive to ozone applications in a gaseous mixture. It that concludes the ozone is a good sanitizer for woods barrels because under certain working conditions eliminated all of yeast presents at both the surface and under the wood, which gives the complete sterility of the woods barrels.

Brettanomyces bruxellensis est une levure particulièrement redoutée des vinificateurs pour ses capacités d’altération organoleptique des vins. Elle est également associée à de nombreux produits fermentés et présente une importante diversité génétique en lien avec son origine écologique. L’analyse des profils microsatellites d’une collection importante d’individus (1318) d’origines géographiques variées montre une diversité génétique importante parmi les isolats de vin. Elle met notamment en évidence la coexistence d’individus diploïdes et triploïdes dans différentes régions du monde ainsi qu’à l’échelle d’un chai et d’un vin. La présence de certains génotypes dans plusieurs régions à travers le monde suggère la dispersion de cette espèce et une adaptation importante au milieu difficile qu’est le vin.La relation entre diversité génétique, matrice d’origine et traits physiologiques a été explorée. La nature des sucres utilisables pour supporter la croissance ainsi que les capacités de production de phénols volatils sont peu variables entre les souches étudiées, indépendamment de leur niveau de ploïdie ou de leur origine écologique. Néanmoins, les profils de croissance et de production de phénols volatils (vitesses et rendements) varient et traduisent des différences dans l’adaptation des souches au milieu et aux conditions d’oxygénation. Nos données suggèrent notamment une adaptation plus importante des souches triploïdes aux conditions physico-chimiques du vin. D’un point de vue pratique, l’influence de certains facteurs physico-chimiques, tels que les sucres et la température, sur le développement de B. bruxellensis dans les vins a été étudiée. Dans les vins rouges, la composition en sucres résiduels ne peut pas être considérée comme un outil de diagnostic du risque « Brett ». Néanmoins, les variations importantes de température observées dans les chais, jusqu’alors sous-estimées, pourraient expliquer en partie les phénomènes d’altération de vins rouges fréquemment observés au cours du premier été d’élevage en barrique. / The yeast species Brettanomyces bruxellensis is the most dreaded wine spoilage microorganism because of its repercussions on wine organoleptic wine alteration. It is also present in numerous fermented beverages and its high genetic diversity is partly associated with its ecological origin. Microsatellite analysis of a large collection of isolates (1318) from various geographical origins shows the species’ high genetic diversity, namely among wine strains. Notably, it highlights the coexistence of diploid and triploid individuals worldwide as well as at the region, winery and wine level. Isolation of some of the genotypes in several wine regions in the world suggests this species’ dispersion as well as the putative adaptation of these individuals to the harsh wine environment.The relationship between genetic diversity, matrix type, and physiological traits was further explored. The type of consumable sugars in relation to growth and phenol volatile production capacities of the studied strains, are independent from the ploidy level or ecological origin of the latter. Nevertheless, growth and phenol volatile production profiles (rates and yields) vary, highlighting differences in strains’ growth capacity in different media and aeration conditions. In particular, our data suggests an important adaptation of triploid strains to wine-type environment. From a practical point of view, influence of physicochemical parameters (such as sugars and temperature) on B. bruxellensis’ development in wine has been investigated. In red wine, residual sugar profiles don’t seem to be a relevant tool to estimate the risk associated with “Brett” spoilage. However, the important temperature variations occurring in wine cellars could be a possible explanation for contamination frequency during the first summer of barrel-ageing.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2014. / ENGLISH ABSTRACT: Brettanomyces bruxellensis has become of increasing interest over the past few decades yet this complex red wine spoilage yeast is still poorly understood and strain variance also leads to the contradictory results reported in literature. This yeast is responsible for the production of phenolic compounds, associated with off-flavours that render wine unpalatable. Sulphur dioxide (SO2) is the most commonly used antioxidant and antimicrobial preservative instrumental in the control of spoilage yeasts such as B. bruxellensis. However, its diploid/triploid genome is enriched for genes that provide the yeast a fortuitous advantage, under conditions permissive for growth, with genotype-dependent SO2 tolerance phenotypes observed among numerous strains. This study investigates the metabolic, physiological and genetic responses associated with SO2 exposure. It also explores the environmental cues responsible for the onset of non-SO2 induced morphological characteristics. These morphological characteristics were investigated using fluorescent probes and microscopy in the presence of SO2 and in the absence thereof, in YPD media. Pseudohyphae formation was observed to be a highly strain dependent feature and less pronounced in the presence of 0.6 mg/L molecular SO2. This study also reports on the metabolic response observed over a 3-week period, following exposure to SO2, in a synthetic wine medium. The following metabolites were consistently monitored during the course of the experiment: acetic acid, acetaldehyde, D-glucose and D-fructose. Utilization of sugars was retarded in the presence of SO2 for up to 10 days in the presence of 1.2 mg/L molecular SO2 and overproduction of acetaldehyde was prominent, with a peak at day 10. The study further highlights the expression profiles observed for the SSU1 gene (referring to SO2 tolerance) and the PAD gene (referring to production of volatile compounds) under SO2 induced conditions in SWM, using qRT-PCR. The co-involvement of increased acetaldehyde production and elevated gene expression were indicative of B. bruxellensis yeast adapting to the presence of molecular SO2, allowing survival of this fascinating yeast. Sequencing of the SSU1 and PAD genes suggests the probable existence of different alleles of these genes that could explicate SO2 tolerance and phenolic compound production associated differences among strains of this species. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Hoewel Brettanomyces bruxellensis oor die afgelope paar dekades toenemende belangstelling gewek het, word hierdie komplekse rooiwynbederfgis steeds swak verstaan en lei rasvariasie ook tot teenstrydige resultate in die literatuur. Hierdie gis is verantwoordelik vir die produksie van fenoliese verbindings, wat geassosieer word met afgeure, wat die wyn onsmaaklik laat. Swaweldioksied (SO2) is die algemeenste preserveermiddel wat, weens antioksidant- en antimikrobiese eienskappe, instrumenteel in die beheer van bederforganismes, soos B. bruxellensis, gebruik word. Nogtans is die diploïede/triploïede genoom vir gene verryk, wat die gis ‘n toevallige voordeel bied tydens ongunstige toestande, met genotipe-afhanklike SO2 weerstandbiedende fenotipes wat onder verskeie rasse waargeneem word. Hierdie studie ondersoek die metaboliese, fisologiese en genetiese reaksies tydens SO2-blootstelling. Dit bestudeer verder die omgewingsleidrade wat vir die aanvang van die nie-SO2 geassosiseerde morfologiese eienskappe verantwoordelik is. Hierdie morfologiese eienskappe is ondersoek met behulp van fluoresserende bakens en mikroskopie in die teenwoordigheid van molekulêre SO2 en, in die afwesigheid daarvan, in YPD-medium. Pseudohyphae-vorming is as ʼn baie rasspesifieke eienskap waargeneem en is minder prominent in die teenwoordigheid van molekulêre SO2. Hierdie studie rappoteer ook oor die metaboliese reaksies waargeneem oor ‘n 3-weke tydperk, na blootstelling aan SO2, in ‘n sintetiese wynmedium. Die volgende metaboliete was voordurend gemonitor tydens die verloop van die eksperiment: asynsuur, asetaldehied, D-glukose en D-fruktose. Benutting van die suikers is in die teenwoordigheid van SO2 vertraag en oorproduksie van asetaldehied is prominent waargeneem. Hierdie studie beklemtoon verder die uitdrukkingsprofiele vir die SSU1-geen (verwys na SO2-weerstandbiedendheid) en die PAD-geen (verwys na die produksie van vlugtige verbindings) in SO2-geïnduseerde toestande in SWM, met behulp van qRT-PCR. Die gesamentlike invloed van beide verhoogde asetaldehied produksie en verhoogde uitdrukking van gene, was beduidend van B. bruxellensis-gis wat aanpas in die teenwoordigheid van molekulêre SO2, wat die oorlewing van hierdie fassinerende gis verseker. Volgordebepaling van die SSU1- en PAD-geen dui daarop dat daar waarskynlik meer as een verskillende alleel vir dié gene bestaan, wat die SO2-verdraagsaamheid en produksie van fenoliese verbindings, wat tans tussen verskeie spesies teenwoordig is, kan verduidelik.

Thermal processing has been used as a means of modifying the sensory aspects of wine. Cabernet Sauvignon wines were heated prior to dejuicing (3C per day from 25C to 42C) or after bottling (42C for 21 days) to determine the effects on total glycosides and glycosidic fractions. Total and phenol-free glycosidic concentrations in the wine and skins were quantified by analysis of glycosyl-glucose. Pre-dejuicing thermal vinification resulted in higher total glycosides (12%), phenol-free glycosides (18%), total hydroxycinnamates (16%), large polymeric pigments (LPP) (208%) small polymeric pigments (SPP) (41%), and lower monomeric pigments (42%) in wines. Skins had lower total glycosides (-16%), and no significant difference in phenol-free glycosides. Post-bottling heat treatment resulted in lower total (-15%) and phenol-free (-16%) glycosides, increased hue (25%), a 62% increase in LPP and a 29% decrease in monmeric pigments. A second study investigated the potential of enological spoilage microorganisms to affect wine aroma, flavor, and color. The activities of b-glucosidase were determined in model systems for fourteen strains of Brettanomyces bruxellensis yeast and nine strains of lactic acid bacteria (Oenococcus oeni). All Brettanomyces strains and seven Oenococcus strains exhibited enzymatic activity. B. bruxellensis b-glucosidase activity was primarily intracellular; O. oeni showed some extracellular activity. Yeasts and bacteria showing activity greater than 1000 nmole mL-1 g -1 for Brettanomyces, or 100 nmole mL-1 g -1 for Oenococcus, were evaluated for their effect on Viognier grape glycosides. Neither was active on native grape glycosides. / Master of Science

Les altérations sensorielles des vins dues à la présence des levures du genre Brettanomyces se caractérisent par une augmentation de la teneur en phénols volatils tel que le 4-éthylphénol. Le premier objectif de ce travail était de faire un état des lieux sur le risque « éthylphénol » au Liban en s'intéressant à la présence d'un précurseur (acide p-coumarique), du microorganisme responsable (Brettanomyces) et du produit final (4-éthylphénol) dans les vins élaborés dans ce pays. Une forte hétérogénéité de concentrations en acide p-coumarique a été observée avec des valeurs variant de 0 à 31,4 mg.L-1. Des niveaux importants de 4-éthylphénols de l'ordre de 1,367 mg.L-1 ont été détectés sur certains vins. Un dépistage du contaminant microbien a permis de confirmer pour la première fois la présence de Brettanomyces au Liban, les proportions restant toutefois assez faibles (3 % des échantillons testés). Une étude génétique a caractérisé les souches retenues qui se sont montrées diverses au sein de l'espèce. Le travail a porté ensuite sur l'analyse cinétique des étapes réactionnelles constituant le processus enzymatique de la bioconversion des substrats acide p-coumarique et 4-vinlphénol en 4-éthylphénol pour 5 souches de Brettanomyces bruxellensis d'origines libanaises et françaises. La variabilité entre les souches s'est exprimée aux niveaux génétique et cinétique. Des profils hétérogènes de bioréaction ont été mis en évidence en fonction de la nature des souches. L'analyse du bilan-matière a révélé l'existence probable de phénomènes d'adsorption sur les parois des Brettanomyces qui sont souche-dépendants. La dernière partie a été consacrée à l'évaluation du lien entre quantité de biomasse et production de 4-éthylphénol ainsi qu'à l'influence de quelques paramètres environnementaux (pH, source d'ammonium et milieu de culture) sur la cinétique réactionnelle. / Wine sensory alterations due to the presence of Brettanomyces yeasts are characterized by an increased content of volatile phenols such as 4-ethylphenol. The first aim of this work was to make an inventory of the "ethylphenol" risks in Lebanon by focusing on the presence of one precursor (p-coumaric acid), the microorganism provoking these risks (Brettanomyces) and the final product (4-ethylphenol) in wines produced in this country. High heterogeneity of p-coumaric acid concentration was observed with values ranging from 0 to 31,4 mg.L-1. Significant levels of 4-ethylphenols of about 1,367 mg L-1 have been detected in some wines. Screening of microbial contaminants confirmed the presence of Brettanomyces for the first time in Lebanon, with proportions remaining relatively low (3 % of samples tested). A genetic study has characterized the selected strains which are shown to be various within the species. The second objective of this study was the kinetic analysis of the reaction steps constituting the bioconversion enzymatic process of both substrates p-coumaric acid and 4-vinlphenol into 4-ethylphenol for 5 strains of Brettanomyces bruxellensis of different origins (Lebanon and France). Variability between strains was expressed at both levels, genetic and kinetic. Heterogeneous bioreaction profiles were identified according to strain's nature. The mass balance analysis revealed the possible existence of adsorption phenomena on the cell walls of Brettanomyces which are strain-dependent. The last part was devoted to the evaluation of the relationship between biomass concentration and production of 4-ethylphenol as well as the influence of some environmental parameters (pH, ammonium source and culture medium) on the reaction's kinetic.

Les nouvelles pratiques utilisées pour l’élaboration du vin amènent à une recrudescence des altérations microbiennes. C’est pourquoi, de nouvelles méthodes doivent être développées afin de quantifier ces microorganismes de façon précise, rapide et avec de faibles coûts. Les principales altérations du vin sont dues aux bactéries acétiques (BA) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans et Ga. liquefaciens) et à Brettanomyces bruxellensis. Par l’action d’enzymes, les 1ères transforment l’éthanol en acide acétique alors que B. bruxellensis transforme les acides hydroxycinnamiques en éthyles phénols (EP) (molécules odorantes désagréables). La cytométrie en flux couplée à la technique d’hybridation in situ en fluorescence a tout d’abord été étudiée. Aucun résultat reproductible n’a été développé pour les BA en vin rouge alors que pour B. bruxellensis, le protocole existant a été amélioré avec une quantification possible en 18 h. La PCR en temps réel a également été utilisées afin de quantifier ces microorganismes. Un protocole a été développé pour la quantification des BA en vin rouge (103 cellules/mL) avec l’utilisation d’un témoin interne microbiologique permettant de valider le rendement de l’extraction de l’ADN. Pour B. bruxellensis, trois kits commerciaux ont été analysés lors d’une étude interlaboratoires. Les quantifications se sont révélées significativement différentes des énumérations sur boite de Pétri avec une quantification des cellules mortes. De plus, il a été étudié et validé l’effet population de B. bruxellensis sur l’efficacité du SO2. Il ressort également de ces expérimentations que les cellules en état viable mais non cultivable ne produisent pas d’EP. / New practices used to elaborate wine lead to an increase of wine spoilage due to microorganisms. That is why, new technics have to be developed to quantify these microorganisms accurately, quickly and with low costs. The main wine spoilages are due to acetic acid bacteria (AAB) (A. aceti, A. pasteurianus, G. oxydans and Ga. liquefaciens) and Brettanomyces bruxellensis development. AAB transforms ethanol to acetic acid while B. bruxellensis transforms hydroxycinnamic acids to ethyl phenols (EP) (unpleasant odor molecules). In order to detect these wine spoilage microrganisms, flow cytometry coupled to fluorescent in situ hybridization has been assessed. No reproducible results have been developed for AAB in red wine while for B. bruxellensis, the existing protocol has been improved with a possible quantification after 18 h compared to 48-72 h in the previous protocol. The real-time PCR was also used to quantify these microorganisms. A protocol has been developed for the AAB quantification in red wine (103 cells/mL) with the use of a microbiological internal control to validate the DNA yield after extraction. For B. bruxellensis, three commercial kits were analyzed in an interlaboratory study. Quantifications were significantly different to the enumerations by Petri dish, with dead cell quantifications. Moreover, we demonstrated that the effectiveness of sulfite is dependent of the B. bruxellensis population. It also appears from these experiments that cells in viable but not culturable state do not produce EP.

Thesis (MSc)--Stellenbosch University, 2012. / ENGLISH ABSTRACT: The yeast Brettanomyces was isolated from beer in 1904 and associated with wine thereafter. A sporulating form, Dekkera, was discovered later. Brettanomyces bruxellensis produces high levels of volatile phenol off-flavours in wine. Sulphur dioxide (SO2) is the most widely used chemical preservative in wine. Yeasts have several mechanisms to cope with the SO2, namely Ssu1p, a membrane bound SO2 transporter; sulphite reduction, sulphite oxidation and acetaldehyde production. In unfavourable environmental conditions, certain yeasts can enter a viable-but-non-culturable (VBNC) state which is characterised by reduced metabolic rate, inability to reproduce on solid media and a reduction of cell size. VBNC can be triggered by chemical stress such as high SO2 levels. The objectives of this study were to examine the SO2 tolerance of B. bruxellensis and Saccharomyces cerevisiae, to quantify their rates of SO2 accumulation and efflux, determine the effect of SO2 on their energy metabolism and investigate if B. bruxellensis possesses an orthologue to S. cerevisiae SSU1. In this study, the identity of a number of Brettanomyces/Dekkera strains was confirmed using 5.8S rDNA-ITS RFLP analysis and DNA sequencing. Sporulation assays were used to confirm whether these strains belonged to the Dekkera or Brettanomyces genus. A method to accurately quantify SO2 in laboratory conditions was optimised. Molecular SO2 tolerance was tested by spotting fresh yeast cultures on media with SO2 and/or ethanol. Tolerance to SO2 and/or ethanol showed highly strain dependent results with S. cerevisiae showing the highest tolerance levels while B. bruxellensis tolerated SO2 and ethanol poorly but certain strains grew well with only SO2. The SO2 accumulation and efflux rates of 3 S. cerevisiae strains and 3 B. bruxellensis strains were determined. It was shown that the S. cerevisiae strains followed the same trends as previously found in literature whereas B. bruxellensis strains showed similar trends but displayed highly variable strain-dependent results. B. bruxellensis CB63 and S. cerevisiae VIN13 were investigated for their response to SO2 in two different media, TA and SWM, over a 48-hour and 32-day period respectively. Acetic acid, acetaldehyde, D-glucose, D-fructose (only in SWM) and ethanol (only in TA) were regularly monitored over the time course of each experiment. SO2 had the greatest impact on B. bruxellensis with decreased rates of glucose consumption and ethanol production as well as increased acetic acid. Acetaldehyde peaked shortly after SO2 addition with the subsequent restarting of sugar consumption for certain samples. This suggests that sufficient acetaldehyde was produced to bind free SO2 to reduce SO2 stress. Volatile phenols were quantified for day 32 of the SWM experiment. An increase of 4-ethyl guaiacol was correlated to higher molecular SO2 levels. SO2 negatively affected both yeasts energy metabolism, forcing the yeasts metabolism to adapt to ensure survival. In general, SO2 was shown to have a negative impact on all aspects of a yeasts growth and metabolism and that SO2 tolerance is highly strain dependent and a far more complicated characteristic than currently understood. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Die gis Brettanomyces is in 1904 uit bier geïsoleer en daarna met wyn geassosieer. 'n sporulerende vorm, Dekkera, is later ontdek. Brettanomyces bruxellensis produseer hoë vlakke van vlugtige fenol afgeure in wyn. Swaweldioksied (SO2) is die mees gebruikte chemiese preserveermiddel in wyn. Giste het verskeie meganismes om SO2 te hanteer, naamlik Ssu1p, 'n membraan-gebonde SO2 transporter, sulfietvermindering, sulfiet-oksidasie en asetaldehiedproduksie. In ongunstige omgewingstoestande kan sekere giste 'n lewensvatbare, maar nie-kultiveerbare (LMNK)-toestand aanneem wat gekenmerk word deur verlaagde metaboliese tempo, onvermoë om voort te plant op soliede media en 'n vermindering van die selgrootte. LMNK kan veroorsaak word deur chemiese stres, soos hoë SO2-vlak. Die doelwitte van hierdie studie was om die SO2 -bestandheid van B. bruxellensis en Saccharomyces cerevisiae te ondersoek, hul spoed van SO2 -opneming/akkumulasie en -uitskeiding te kwantifiseer, die invloed van SO2 op energiemetabolisme te bepaal en te ondersoek of B. bruxellensis oor ‘n soortgelyke geen as die S. cerevisiae SSU1 beskik. In hierdie studie is die identiteit van 'n aantal Brettanomyces/Dekkera-stamme bevestig deur 5.8S rDNA-ITS RFLP-analise en DNA-opeenvolging te gebruik. Sporulasietoetse is gebruik om te bevestig of hierdie stamme aan die genus Dekkera of Brettanomyces behoort. 'n Metode om SO2 onder laboratoriumtoestande akkuraat te kwantifiseer, is geoptimiseer. Molekulêre SO2- bestandheid is getoets deur vars giskulture op media met SO2 en/of etanol te groei. Bestandheid teen SO2 en/of etanol het stam-afhanklike resultate getoon, S. cerevisiae wat die hoogste toleransievlakke getoon het, terwyl B. bruxellensis SO2 en etanol swak tolereer, maar sekere stamme het goed gegroei met slegs SO2. Die SO2-akkumulasie en -uitskeidingtempo van 3 S. cerevisiae-rasse en 3 B. bruxellensis-stamme is bepaal. Daar is gevind dat die S. cerevisiae-rasse dieselfde tendens soos voorheen in die literatuur beskryf, gevolg het, terwyl B. bruxellensis-stamme soortgelyke tendense getoon het,maar hoogs veranderlike stamafhanklike resultate vertoon. B. bruxellensis CB63 en S. cerevisiae VIN13 is ondersoek vir hul reaksie tot SO2 in twee verskillende media, TA en SWM, oor 'n tydperk van 48-uur en 32-dae onderskeidelik. Asynsuur, asetaldehied, D-glukose, D-fruktose (slegs in SWM) en etanol (slegs in TA) is gereeld gemoniteer oor die verloop van elke eksperiment. SO2 het die grootste impak op B. bruxellensis met ‘n verlaagde tempo van glukoseverbruik en etanolproduksie, sowel as verhoogde asynsuur. ‘n Asetaldehiedhoogtepunt is bereik kort na die SO2-byvoeging met die daaropvolgende hervatting van suiker wat vir sekere monsters gebruik is. Dit dui daarop dat voldoende asetaldehied geproduseer is om vry SO2 te bind om SO2-stres te verminder. Vlugtige fenole is op dag 32 van die SWM-eksperiment gekwantifiseer. 'n Toename van 4-etiel-guajakol korreleer met hoër molekulêre SO2-vlakke. SO2 het beide giste se energiemetabolisme negatief beïnvloed, wat die gis dwing om sy metabolisme aan te pas om oorlewing te verseker. Oor die algemeen het SO2 'n negatiewe impak op alle aspekte van giste se groei en metabolisme, en SO2-bestandheid is hoogs stam–afhanklik. Dit is ook 'n baie meer ingewikkelde kenmerk as wat tans verstaan word.