Ulm, Univ., Diss., 2007.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Zugl.: München, Techn. Universiẗat, Diss., 2009.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death. / Humaner adulter Knorpel besitzt weder Blutgefäße noch Nerven, weswegen diese Knorpelart im Vergleich zu anderen Gewebetypen ein verringertes Wachstum und Regenerierung wiederspiegelt. Den Hauptteil der Zellen im adulten Knorpel stellen die Chondrozyten (Knorpelzellen)dar, welche sich zuvor aus humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) entwickelt haben. Sie sind verantwortlich für die Bildung und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix (ECM) des Knorpelgewebes, welche hauptsächlich aus Kollagen und Proteoglykanen besteht. Signale, die durch Chondrozyten erzeugt oder weitergeleitet werden, finden in der Regel durch Interaktion mit Molekülen der im Knorpel liegenden ECM statt. Mitglieder der CCN-Familie gelten hierbei als bedeutende extrazelluläre Matrixproteine, die bei verschiedenen regulatorischen Prozessen während der Skelettentwicklung und der Frakturheilung eine Rolle spielen. In dieser Doktorarbeit liegt das Hauptaugenmerk auf dem CCN Protein WISP1/CCN4. Dieses Protein gilt bereits in verschiedenen Zellen als ein notwendiger Überlebensfaktor und scheint desWeiteren eine regulatorische Funktion während der Differenzierung von hMSCs in Chondrozyten auszuüben. Die generelle Bedeutung von WISP1 für das muskuloskelettale System ist bislang jedoch weitgehend ungeklärt und soll während dieser Doktorarbeit mittels einer Reihe von molekular- und zellbiologischer Methoden genauer untersucht werden. Hierfür wurde zu Beginn eine erfolgreiche Herunterregulierung endogen hergestellter WISP1 Transkripte mittels Genexpressionshemmung (gene-silencing) in verschiedenen muskuloskelettalen Zellen erzielt. Interessanterweise scheint WISP1 eine bedeutende Rolle für das Überleben dieser Zellen zu spielen, da ein Verlust bei allen untersuchten Zelllinien und primären hMSCs zum Zelltod führte. Um zu Grunde liegende Mechanismen genauer zu untersuchen, wurden daraufhin Microarray Analysen von hMSCs und Tc28a2 Chondrocyten durchgeführt (jeweils WISP1 herunterreguliert vs Kontrollzellen). In diesem Zusammenhang identifizierten bioinformatische Analysen differentielle Expressionen verschiedener apoptoseresponsiver Gene. So scheint eine Apoptoseinduktion über TRAIL und/oder p53 in hMSCs stattzufinden, wohingegen eine starke Regulation des MAPK-Signalweges in Chondrozyten detektiert wurde. Neben diesen Genregulationen, deckten die Analysen ebenso Gengruppen auf, die bei anderen wichtigen zellulären Abläufen eine Rolle spielen. Hier sind in WISP1 herunterregulierten hMSCs u.a. viele differenziell exprimierte Gene zu nennen, die durch Interferone induzierbar sind. In Chondrozyten dagegen scheint eine verringerte WISP1 Expression Genexpressionen zu beeinflussen, welche die Knorpelhomeostase regulieren. Die Ergebnisse, die während dieser Doktorarbeit erzielt wurden, verdeutlichen die Wichtigkeit von WISP1 für das Überleben von primären hMSCs und Chondrozyten. Darüberhinaus verstärken die bioinformatischen Analysen die Annahme, das WISP1 regulatorische Funktionen für die Knorpelhomeostase ausübt. Somit bietet diese Doktorarbeit ein essentielles Fundament, um die Rolle von WISP1 bei der Aufrechterhaltung der Knorpelhomeostase und des Zelltodes weiter zu erforschen.

WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes. WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis. Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells. / WISP3 ist ein Mitglied der CCN-Familie, die aus sechs Familienmitgliedern besteht und in den 1990er Jahren endeckt wurde: Cysteine-rich, angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) und den Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6). Die CCN-Proteine sind durch ihre Interaktion mit verschiede- nen Integrinen und Heparansulfaten involviert in die Regulation der Adhäsion, der Migration, der Mi- togenese, der Chemotaxis, der Proliferation, des Zellüberlebens, der Angiogenese, der Tumorgenese und der Wundheilung. WISP3 ist momentan das einzige Mitglied, das direkt mit einer muskuloskelettalen Erkrankung, der Progressiven Pseudorheumatoiden Dysplasie (PPD), assoziiert wird. PPD ist charakter- isiert durch eine normale embryonale Entwicklung mit fortschreitender Knorpeldegeneration beginnend im Alter von drei bis acht Jahren. Tierversuche mit knock out oder Überexpression von WISP3 in Mäusen waren nicht in der Lage die Symptome der Erkrankung nachzustellen, da keine Unterschiede im Vergleich zu den Wurfgeschwistern beobachtbar waren. In vitro und in vivo Studien offenbarten eine antagonisierende Rolle für WISP3 im BMP, IGF und Wnt Signalweg. Da die meisten Informationen über WISP3 jedoch in Epithel- und Krebszellen sowie immortalisierten Chondrozytenzelllinien generiert wurden, untersuchten wir die Rolle von WISP3 in primären humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) und primären Chondrozyten. Der WISP3 knock down wurde mit drei short hairpin RNAs in beiden Zelltypen etabliert und wies eine veränderte Zellmorphologie sowie eine reduzierte Zellzahl auf. Knock down mit gleichzeitiger rekombi- nanter WISP3-Behandlung konnte den beobachteten Phänotyp sowie den Zellverlust nicht retten und auch eine Änderung der endogenen Genexpression von WISP3 war nicht zu detektieren. Schlussfolgernd muss WISP3 ein wichtiger Überlebensfaktor sein, dessen Verlust zur Überschreitung von Zellzyklus- Kontrollpunkten führt, was in Apoptose mündet. Apoptosenachweise wie Annexin V-Cy3 Färbung, Immunfluoreszenzfärbung und Western blot für aktive Caspasen lieferten keine positiven Beweise für diese Form des Zelltodes. Auch die Genexpression der Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2, wichtig für die extrinsische Aktivierung der Apoptose, zeigte kein verändertes Expressionsmuster in WISP3-defizienten hMSZs. Autophagie als Zelltod wurde ebenfalls ausgeschlossen, nachdem im West- ern Blot kein gespaltene Form des Autophagiemarkers LC3 A/B zu detektieren war. Um die Rolle von WISP3 beim Zelltod weiter zu entschlüsseln, wurden Genom-Expressionsanalysen von WISP3-defizienten hMSZs im Vergleich zu Kontroll-hMSZs angefertigt. Die Analysen ergaben unterschiedlich regulierte Gene vor allem in den Bereichen Zellzyklus-Regulation, Adhäsion, Zytoskelett und Zelltod. Der durch WISP3-Verlust ausgelöste Zelltod kann möglicherweise durch die Aktivierung der Nektroptose über den BMP/TAK1/RIPK1 Signalweg erklärt werden. Es ist bekannt, dass WISP3 BMP4 bindet und so dessen Bindung an den Rezeptor verhindert. Bei WISP3 Verlust bindet BMP4 an seinen Rezeptor und aktiviert den Smad 2/3/4 Komplex der wiederum TAK1 phosphoryliert, wie zuvor in Epithelzellen demonstriert. TAK1 ist in der Lage die Caspase-induzierte Apoptose zu blockieren und auf diese Weise die Bildung des Nekrosomes auszulösen, welches zum Zelluntergang durch Nekroptose führt. Zusammen mit seiner Rolle in der Zellzyklus-Kontrolle und der extrazellulären Matrixadhäsion, die in humanen Brustepithelialzellen nachgewiesen wurden, unterstützen diese Daten eine Rolle für WISP3 als Tumorsuppressor und Überlebensfaktor in Zellen des Epithel und des muskuloskelettalen Systems.

Traumatische und/oder degenerative, umschriebene Knorpeldefekte sind aufgrund der schlechten intrinsischen Regenerationseigenschaften des Knorpelgewebes immer noch eine chirurgische Herausforderung. Therapiemöglichkeiten mittels Knorpelrekonstruktion durch autologes Knorpelgewebe hat den Nachteil der „donor-site-morbidity“ und auch die mit guten klinischen und bildmorphologischen Ergebnissen bereits in der Klinik angewandte matrixgekoppelte autologe Chondrozytentransplantation kommt nicht ohne eine zusätzliche Operation und Entnahme von Knorpelgewebe aus. Autologe mesenchymale Stammzellen sind einfach mittels Beckenkammpunktion zu gewinnen und stellen aufgrund ihres Proliferations- und chondrogenen Differenzierungsvermögens eine vielversprechende Alternative dar. Die Tissue Engineering Division des orthopädischen König-Ludwig-Hauses in Würzburg befasst sich nun seit mehreren Jahren in verschiedenen Versuchsreihen unter anderem mit dieser Alternative der Knorpelrekonstruktion. Vor allem die Optimierung der Nutzung von Stammzellen, die Vordifferenzierungsmöglichkeiten in vitro und das Verhalten in verschiedenen Trägermatrizes wird erforscht. Die vorliegende Arbeit stellt eine Pilotstudie zur Anwendung von Stammzellen analog zu der in klinischer Anwendung befindlichen MACT in vivo in Göttinger Minipigs vor. Wir haben zeigen können, wenn auch nur mit einer geringen Fallzahl und fehlenden signifikanten Aussagen, dass Stammzellen eine vielversprechende Alternative zu Chondrozyten in der Versorgung von Gelenkknorpeldefekten darstellen. Eine Verarbeitung in Kollagen I Hydrogelen ist in gleicher Weise wie mit den Chondrozyten möglich und auch die mechanische Stabilität differiert nicht. Die histologischen und immunhistochemischen Auswertungen haben in den Stammzelltransplantaten gleich gute, in einigen Aspekten sogar gering bessere Ergebnisse erzielt als die bewährten Chondrozytentransplantate. In der Nachbehandlung schien die sofortige volle Belastung der frisch operierten Kniegelenke bei den Minipigs möglicherweise problematisch in Bezug auf die Fixierung und den Verbleib der Gel-Transplantate im Defekt. In der Klinik ist eine zeitweise Teilbelastung und anfangs lediglich passive Bewegung des Gelenks natürlich problemlos möglich. In der Zukunft werden durch Vordifferenzierung und Markierung der Stammzellen sowie durch Vorauswahl von Zellen mit einem hohen chondrogenen Differenzierungspotential die Ergebnisse von ähnlichen Versuchsreihen sicher noch optimiert werden können. / Repair of full-thickness cartilage defects with autologous chondrocytes and autologous mesenchymal stem cells in a collagen-I-hydrogel - a pilot study in mini-pigs

Zugl.: Berlin, Freie Univ., Diss., 2008

Universiẗat, Diss., 2004--Münster (Westfalen).

Für die Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten des Kniegelenkes in Folge eines Traumas oder einer Osteochondrosis dissecans (OD) stehen verschiedene operative Verfahren zur Verfügung. Die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) hat sich als zuverlässiges Rekonstruktionsverfahren erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine prospektive Fallseriestudie für eine neue Form der ACT mit einem Kollagen I Hydrogel (CaReS-Technologie) durchgeführt. Die Vorteile der Technologie liegen zum Einen darin, dass sich die Zellen homogen im Gel verteilen und zum Anderen, dass die Zellen unmittelbar nach dem Herauslösen aus dem Gelenkknorpel in das Gel eingebracht werden und dadurch eine geringere Dedifferenzierung der Chondrozyten stattfindet. Von März 2003 bis Ende 2006 wurden 29 Patienten in die Studie eingeschlossen. Die Ein- und Ausschlusskriterien erfüllten die Kriterien der Arbeitsgruppe ACT und Tissue Engineering der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Unfallchirurgie. Die Eingangs- und Nachuntersuchungsbögen wurden an die IKDC Form 2000 angelehnt. Insgesamt zeigte sich ein signifikanter Anstieg des IKDC Scores im mittleren follow-up von 30,7 Monaten von 47,3 auf 74,9 bei den 29 Patienten. Bei Aufschlüsselung der Patienten bzgl. Diagnose, Defektgröße, Lokalisation und Defektanzahl zeigte sich bei den Behandlungsgruppen OD, Trauma/degenerativ, > 4 cm2, mediale Femurkondyle und Einzeldefekte eine signifikante Zunahme des IKDC Scores im zeitlichen Verlauf. Der postoperative Schmerz zeigte einhergehend mit dem Anstieg des IKDC Scores eine signifikante Abnahme der Schmerzintensität in den Behandlungsgruppen OD, Trauma/degenerativ, > 4 cm2, mediale Femurkondyle und Einzeldefekte. Nachgewiesen wurde ebenfalls ein Anstieg des SF36 Scores, der den gegenwärtigen Gesundheitszustand sowohl körperlich als auch psychisch beurteilt. Zusammen mit einer globalen Patientenzufriedenheit von 80% und einem IKDC Funktionsstatus von I und II bei 77% der Patienten spiegeln die gewonnenen Daten die Ergebnisse der klassischen ACT bzw. anderer matrixgekoppelten Verfahren wieder. Die CaReS-Technologie stellt somit ein gleichwertiges Verfahren zu den bisher auf dem Markt befindlichen Techniken der ACT dar. / For the reconstruction of articular cartilage defects of the knee resulting from osteochondritis dissecans (OD) or trauma different surgical techgniques are available. Autologous chondrocyte implantation (ACI) has proven to be a reliable reconstructive technique. In this work, we have performed a prospective case control study using a new form of ACI with a collagen type I hydrogel (CaReS-technology). The advantages of the technology are that the cells can be distributed homogeneously within the hydrogel and immidiatly after their release from the cartilage they are brought into the gel, resulting in less dedifferentiation of the chondrocytes. From March 2003 to the end of 2006 we enrolled 29 patients in this study. The inclusion and exclusion criteria were adopted from the criteria of the working group for ACT and Tissue Engineereing of the German Society for Orthopaedic and Trauma Surgery. The inital clinical and follow-up examinations were performed according to the IKDC form 2000. In general, we found a significant increase of the IKDC score at the follow-up of 30.7 months from 47.3 to 74.9 of the 29 patients. When seperating the patients by diagnosis, defect size, defect location and defect number we found in the groups with OD, trauma/degenerativ, > 4 cm2, medial condyle and single defects a significant increase of the IKDC score over the follow-up period. The postoperative pain showed accoring to the increased IKDC score a significant decrease of the pain intensity in the groups with OD, trauma/degenerativ, > 4 cm2, medial condyle and single defects. We also found an increase of the SF36 score, which describes the current physical and mental health status. Together with a global patient satisfaction of 80% and an IKDC functional status of I and II in 77% of the patients our data reflect the results of the classical ACI, as well as other matrix-based technologies. Therefore, the CaReS-technology is comparable to other technologies which are currently on the market.