In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals mit Hilfe von drei unterschiedlichen experimentellen Modellen der Einfluß von Adrenomedullin (ADM) auf die myokardiale Kontraktilität des Rattenherzens untersucht. Die Methodik umfaßte die Verwendung des isolierten Herzen nach Langendorff, des isolierten Papillarmuskelpräparats und der konfokalen Laserscan Mikroskopie bei adulten Kardiomyozyten. In keinem der Ansätze konnte ein direkter Effekt von ADM auf die Kontraktilität nachgewiesen werden. An isolierten adulten Kardiomyozyten hatte ADM weder Einfluß auf die systolische Zellverkürzung noch auf den gleichzeitig registrierten zytosolischen Kalziumgehalt. Auch an isolierten Papillarmuskeln verursachte ADM keine Änderung der maximalen Kraftentwicklung oder Kraftanstiegsgeschwindigkeit. Endothelin-1 wurde sowohl am Papillarmuskelpräparat als auch an isolierten, adulten Kardiomyozyten als Positiv-Kontrolle verwendet und verursachte in beiden Versuchsaufbauten einen deutlichen Anstieg der kontraktilen Parameter. Als dritte Methode wurde das isoliert perfundierte Herz nach Langendorff verwendet. Unter Gabe von ADM zeigte sich ein Abfall des koronaren Perfusionsdrucks, entsprechend den bereits bekannten vasodilatierenden Eigenschaften des Peptids. Dieser Effekt war zwar begleitet von einer Abnahme der kontraktilen Parameter der Herzen, allerdings ist am isoliert und flußkonstant perfundierten Herz eine Abnahme des koronaren Perfusionsdrucks aufgrund des Gregg-Phänomes mit einer Abnahme der Kontraktilität vergesellschaftet. Aus den Ergebnissen dieser Arbeit kann daher der Schluß gezogen werden, das Adrenomedullin keinen Einfluß auf die Kontraktilität des Rattenherz hat. / The objective of this study was to investigate the influence of Adrenomedullin (ADM) on myocardial contractility of the rat heart in three different experimental models. First in the isolated rat heart preparation (Langendorf), second on the isolated papillary muscle preparation and third with confocal laserscan microscopy of isolated adult cardiomyocytes. None of these experimental models could show a direct effect of ADM on the contractility of the rat heart. In isolated adult cardiomyocytes, ADM had no influence on systolic cell shorting or on the simultaneously registered cytosolic calcium concentration. In isolated papillary muscle preparation ADM administration did not change maximal contractile force or time constants of contraction. Endothelin-1 was used as a positive control in both experimental setups and induced a marked increase in contraction parameters. In the isolated rat heart preparation (Langendorff), ADM induced a decrease of the coronary perfusion pressure, reflecting the already well described vasodilatatory properties of this peptide. This decrease was paralleled by a reduction of the contractile parameters of the heart, but in isolated rat heart preparations with constant coronary flow, a reduction of coronary perfusion pressure is always paralleled by a decrease of contractility due to the Gregg-Phenomenon. In conclusion the results of this study show that Adrenomedullin has no influence on myocardial contractility in the rat heart.

Kardialen Strukturen, wie dem koronaren oder endokardialen Endothel, dem Myokard und auch dem Perikard werden unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zunehmend autokrine oder parakrine Funktionen zugesprochen. Es ist gut belegt, dass das Herz durch Freisetzung von löslichen Mediatoren nach Myokardischämie einen entscheidenden Anteil an der postischämischen Regulation der Vasomotion hat. Allerdings weniger bekannt ist die Bedeutung einer Mediator-vermittelten kardialen Autoregulation bei postischämischen Veränderungen der Myokardkontraktilität. In dieser Arbeit wird eine neue negativ inotrope Substanz(en) (NIS) beschrieben, die nach myokardialer Ischämie aus isolierten Herzen freigesetzt wird und die an sequentiell perfundierten Herzen, die als Bioassay eingesetzt werden, einen deutlichen kardiodepressiven Effekt hervorruft. In isolierten Feld-stimulierten Rattenkardiomyozyten reduziert NIS dosisabhängig die systolische Zellverkürzung und den Ca2+-Transienten (Konfokale Laser Scan Mikroskopie). Der negativ inotrope Effekt setzt sowohl in isolierten Herzen als auch Kardiomyozyten schnell ein und ist reversibel. Katecholamine maskieren und überspielen den negativ inotropen Effekt in Abhängigkeit von der Ischämiedauer. Voltage clamp Untersuchungen auf Einzelzellebene zeigten, dass NIS den Ca2+-Einstrom Ica über die L-Typ Ca2+-Kanäle reduziert. Somit scheint NIS die Myokardkontraktilität und Zellverkürzung über eine Verminderung der intrazellulären systolischen Ca2+-Konzentrationen durch Blockade der L-Typ Ca2+-Kanäle zu reduzieren und nicht etwa über eine Ca2+-Desensitivierung. Derzeit ist noch nicht geklärt, über welchen Mechanismus NIS den Ca2+-Einstrom blockiert. Da weder die Gewebsspiegel von cGMP und cAMP noch die PKA Aktivität durch NIS moduliert werden, ist es unwahrscheinlich, dass eine Dephosphorylierung von Untereinheiten des L-Typ Ca2+-Kanals der Funktionsweise von NIS zu Grunde liegt. Die Ergebnisse legen nahe, dass NIS direkt mit dem Ca2+-Kanal interagiert, z.B. durch Bindung an ein Kanalprotein. Die chemische Struktur von NIS ist derzeit noch ungeklärt, allerdings gibt es Hinweise, dass es sich nicht um ein Protein handelt. Die Substanz(en) ist stabil, Hitze-resistent (56°) und ein dialysierbares Molekül mit einem geringen Molekulargewicht (< 0.5 kDa). Die kardiodepressorische Substanz(en) wird nicht vom Koronarendothel freigesetzt. Eine abschließende Bewertung, ob NIS durch Aggravation der kontraktilen Dysfunktion myokardschädigend oder durch Senkung des myokardialen Sauerstoffverbrauches kardioprotektiv wirkt, ist derzeit noch nicht möglich. / Autocrine and paracrine functions are increasingly being attributed under physiological and pathophysiological conditions to cardiac structures such as the coronary or endocardial endothelium, the myocardium, and the pericardium as well. Reliable evidence exists to confirm that the heart, through the release of soluble mediators after myocardial ischemia, plays a decisive role in post-ischemic regulation of vasomotion. Less well-known, however, is the significance of mediator-effected cardiac autoregulation in cases of post-ischemic changes of myocardial contractility. This study describes a new negative inotropic substance or substances, NIS, released from isolated hearts after myocardial ischemia. NIS elicits marked cardiodepressive effects on sequentially perfused hearts used as bioassays. In isolated field-stimulated rat cardiomyocytes, NIS reduces, as a function of dose, systolic cell shortening and Ca2+ transients (as detected by confocal laser-scan microscopy). The negative inotropic effect occurs quickly both in isolated hearts as well as in cardiomyocytes, and is reversible. Catecholamines counteract the negative inotropic effect, as a function of ischemia duration. Voltage-clamp investigations on the single-cell level have disclosed that NIS reduces Ca2+ inflow Ica via L-type Ca2+ channels. NIS appears to decrease myocardial contractility and cell shortening through reduction of intracellular systolic Ca2+ concentration, by blockade of L-type Ca2+ channels: and not, say, by Ca2+ desensitization. It has not yet been definitely established by which mechanism NIS blocks Ca2+ inflow. Since NIS modulates neither the tissue level of cGMP and cAMP, nor PKA activity, it is improbable that NIS acts by dephosphorization of sub-units of the L-type Ca2+ channel. The results of this study imply that NIS directly interacts with the Ca2+ channel, perhaps by binding to a channel protein. Although the chemical structure of NIS has not yet been elucidated, there are indications that it is not a protein. The substance(s) is/are stable, heat resistant (up to 56°C), and dialyzable as a molecule with low molecular weight (< 0.5 kDa). It is not yet possible to provide conclusive evaluation of whether NIS acts to damage the myocardium by aggravation of the contractile dysfunction, or whether it exerts cardioprotective action by diminishing myocardial oxygen consumption.

Die meisten Patienten mit hypertropher Kardiomyopathie und kongenitalen Herzerkrankungen exprimieren die atriale essentielle leichte Myosinkette (ALC-1) im Ventrikel, wo sie teilweise die ventrikuläre essentielle leichte Myosinkette (VLC-1) ersetzt. Diese VLC-1/ALC-1 Isoformveränderung korrelierte mit einem Anstieg der Zykluskinetik der Myosin-Querbrücken in chemisch gehäuteten Herzfasern aus hypertrophierten Humanventrikeln. Um die funktionelle Bedeutung der ALC-1 im gesamten intakten Herzen zu untersuchen, habe ich in der vorliegenden Arbeit ein transgenes Rattenmodell charakterisiert, das die humane ALC-1 (hALC-1) im Herzen exprimiert (TGR/hALC-1). WKY-Ratten dienten als genetisch korrekter Kontrollstamm. Mittels rekombinanter hALC-1 als Standard wurde die exprimierte hALC-1-Menge in SDS-Extrakten linker Ventrikel der TGR/hALC-1 im Western-Blot untersucht. 12 Wochen alte TGR/hALC-1 exprimierten etwa 17 mug hALC-1/mg SDS-Extrakt. Das exprimierte Transgen konnte in der Immunfluoreszenz zwischen den Z-Linien der Sarkomere lokalisiert werden. Die gerichtete Integrations des Transgens in das kardiale Myosinmolekül wurde zusätzlich noch in hochgereinigten Myosinpräparationen nachgewiesen. Analyse des linksventrikulären Proteoms durch 2D-PAGE, das zur Identifikation von etwa 3000 Proteinen führte, zeigte vergleichbare Proteinmuster in WKY und TGR/hALC-1. Die Untersuchungen der Kontraktilität des intakten isoliert perfundierten Herzen wurden mit Langendorff-Präparationen durchgeführt. Die Expression des hALC-1-Transgen führte zu statistisch signifikanten (p / Most patients with hypertrophic cardiomyopathy and congenital heart diseases express the atrial essential myosin light chains (ALC-1) in their ventricles, partially replacing the ventricular essential light chains (VLC-1). This VLC-1/ALC-1 isoform shift is correlated with an increase in cross-bridge cycling kinetics as measured using chemically skinned fibers from the hypertrophied ventricles of human hearts. To study the functional importance of hALC-1 in the whole intact perfused-heart, a transgenic rat model overexpressing hALC-1 (TGR/hALC-1) in the heart was generated. WKY rats were used as the respective genetically correct control strain. Using hALC-1HIST protein as a standard, the amount of transgenic protein expression was quantified by Immunoblot analysis of the left ventricular tissue extracts of the transgenic rats. Twelve-week-old TGR/hALC-1 expressed around 17mug hALC-1 per mg of whole SDS-soluble protein. The transgene was localized in-between the Z-lines of the sarcomere by immunofluoresecnce microscopy. Furthermore, the proper integration of the transgene into the rat ventricular myosin was confirmed by purifying myosin from rat ventricular tissues. Whole ventricular proteome analysis by 2D-PAGE, resolved approximately 3000 proteins spots in each TGR/hALC-1 and WKY animal. The whole protein expression patterns in both animal groups showed no differences with the exception of the transgenic hALC-1 protein spot. The perfused heart contractility parameters were evaluated using the Langendorff preparation. Expression of hALC-1 was accompanied by statistically significant improvements (p

Es wurden die Effekte von Plättchenaktivierendem Faktor (PAF, 1-O-Alkyl-2-azetyl-sn-glyzero-3-phosphocholin) auf intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge isolierter und feldstimulierter Kardiomyozyten der Ratte untersucht. Intrazelluläre Kalziumkonzentration und Zelllänge der feldstimulierten Zellen wurden mittels Laser-Raster-Mikroskopie simultan unter Verwendung des Kalzium-Fluoreszenzfarbstoffes Fluo-3 bestimmt. PAF (0.001nM - 10nM) inhibierte den systolischen Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration zeit- und konzentrationsabhängig. Die maximalen Effekte wurden nach einer Inkubationszeit von 6-8 min beobachtet. Es kam zu 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) und 52% (10nM PAF) Reduktion des systolischen Kalziumanstiegs. Zusätzlich konnte eine zeit- und konzentrationsabhängige Verringerung der simultan gemessenen Zellverkürzung nachgewiesen werden. Die Zellverkürzung war nach einer Inkubationszeit von 8 min um 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) und 50% (10nM PAF) reduziert. Die Wirkungen von PAF konnten durch den Einsatz des spezifischen PAF-Rezeptorantagonisten WEB 2170 inhibiert werden. Diese Ergebnisse zeigen einen rezeptorvermittelten negativ inotropen Effekt von PAF, hervorgerufen durch eine Verringerung der systolischen intrazellulären Kalziumkonzentration ohne Desensibilisierung der Myofilamente. / We investigated the effects of platelet-activating factor (PAF, 1-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-phosphocholine) on intracellular calciumconcentration and cell length in isolated and field-stimulated rat cardiomyocytes. Intracellular calciumconcentration and cell length of field-stimulated cells were determined simultaneously by confocal laser scan microscopy by using the fluorescent calcium dye Fluo-3. PAF (0.001nM - 10nM) inhibited systolic intracellular calciumconcentration increase in a time- and concentration-dependent manner. Maximal effects were observed after an incubation time of 6-8 min, resulting in a 17% (0.001nM), 41% (0.1nM) and 52% (10nM PAF) inhibiton of systolic calcium increase. A time- and concentration-dependent decrease in simultaneously measured cell shortening also was demonstrated. Cell shortening was inhibited by 10% (0.001nM), 32% (0.1nM) and 50% (10nM PAF) after an incubation time of 8 min. The effects of PAF could be antagonized by the PAF-receptor antagonist WEB 2170. These data demonstrate that PAF receptor-dependently induces a negativ inotropic effect, which is correlated with a decrease in systolic intracellular calciumconcentration and is most likely not due to a decrease in myofilament sensitivity.

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