Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Durante el proceso de daño oxidativo, en la célula se alteran una serie de biomoléculas como el ADN, proteínas y lípidos. El daño oxidativo de los lípidos se denomina lipoperoxidación (LP), que afecta principalmente a los lípidos de membrana. Durante la LP se liberan numerosas moléculas que pueden ser consideradas como marcadoras del proceso. El malondialdehído (MDA) es un aldehído producido durante la LP, que se ha utilizado comúnmente como marcador, a través de la metodología de las sustancias reactivas al ácido tiobartitúrico (TBARS). Esta metodología presenta problemas de especificidad principalmente cuando se utiliza en fluidos biológicos y muestras de tejidos, por lo que en este trabajo se evaluó la metodología del 3-metil-2-benzotiazolidon hidrazona (MBTH) como una alternativa al TBARS en la determinación de los productos de la LP. Esto debido a que para el MBTH se ha descrito la capacidad de reaccionar con aldehídos presentes en el líquido sinovial (LS), cuyo origen se ha asociado a la degradación del colágeno II. Además se determinó el grado de especificidad reactiva de ambas metodologías evaluándolas en sistemas con distintos aldehídos (acetaldehído, propionaldehído, glutaraldialdehído y benzaldehído) y con glucosa (a una concentración de 10-1M), ya que esta molécula presenta un grupo aldehído en su estructura. Finalmente, se evaluó el efecto antioxidante (AO) del LS con ambas metodologías. Todos estos ensayos se realizaron en un sistema biológico constituido por una fracción microsomal obtenida a partir de hígado de equino y se evaluaron espectrofotométricamente. Se aplicó la metodología del TBARS a la fracción microsomal de hígado equino y se logró estandarizar la metodología del MBTH para la determinación de los productos de la LP in vitro. Al evaluar la especificidad reactiva de ambas metodologías con los distintos aldehídos, se encontró que el MBTH reaccionaba con los aldehídos a una menor concentración de lo que lo hacía el TBARS. Con la glucosa 10-1M, ni la metodología del MBTH ni la del TBARS generaron reacción colorimétrica, descartando, que bajo estas condiciones experimentales, la glucosa se comporte como un interferente de la reacción. Finalmente, el LS no manifestó su capacidad AO con ninguna de las metodologías utilizadas, incluso con el MBTH, al agregarle LS a la fracción de membrana se generó una curva ascendente proporcional a los volúmenes de LS adicionados. Estos resultados sugieren la posibilidad de que el MBTH sea más sensible a los productos de la LP que el TBARS, y que el cambio en el sistema biológico utilizado (de hígado de rata a hígado de equino) pudiera afectar en la capacidad AO del LS

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias mención Patología Animal. / El objetivo planteado para esta tesis fue investigar la presencia de la proteína Calreticulina en el líquido sinovial de la articulación radio carpal de equinos Fina Sangre Inglés, mediante métodos moleculares y de esta manera describir una proteína que hasta la fecha no se ha identificado en la especie equina. Para lo anterior, se utilizaron 5 equinos clínicamente sanos, desde los cuales se obtuvo una muestra de líquido sinovial para su posterior estudio. Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida que se analizó mediante inmuno electro transferencia (IWB) utilizando anticuerpos anti Calreticulina humana (HuCRT) y anti Calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT), permitiendo un reconocimiento antigénico de la proteína. Se utilizó HuCRT y TcCRT como control (+). Adicionalmente, se estudió la capacidad in vitro de la Calreticulina presente en el líquido sinovial para unirse a C1q del sistema de complemento, lo cual fue estudiado mediante inmuno electro transferencia. También, se efectuaron ensayos con el objetivo de modificar el patrón electroforético de las proteínas del líquido sinovial equino para disminuir la concentración de las proteínas más abundantes, y con ello aumentar relativamente las proteínas que se encuentran en menor concentración. Finalmente, se realizó una espectrometría de masas (MALDI-TOF) y una espectroscopia de Raman con el objeto de identificar y confirmar que la proteína inmuno reactiva fuese CRT. En la IWB se evidenció una reacción positiva por la aparición de una banda de aproximadamente 50 kDa la cual fue evidenciada con el anticuerpo anti HuCRT. El desafío a C1q no generó una reacción positiva, no pudiendo evidenciarse la unión de CRT del líquido sinovial equino al componente C1q del complemento. La presencia de la proteína CRT en el líquido sinovial equino, utilizando el diseño experimental planteado, no pudo ser confirmada por espectrometría de masas como por espectroscopía de Raman, necesitándose diseñar otros experimentos para separar y aislar más específicamente la proteína en estudio. La Calreticulina equina (EqCRT) fue reconocida principalmente por el anticuerpo anti HuCRT y no así por el anticuerpo anti TcCRT, lo que se debe probablemente a una mayor homología entre ambas proteínas a diferencia de la proteína del equino con la proteína de Trypanosoma cruzi. Por otro lado, el que no hubiese reacción al realizar el desafío frente a C1q, no quiere decir que la “EqCRT” no se una a C1q y puede haber sido más que nada un problema de diseño experimental en donde se utilizaron concentraciones muy bajas de proteína, no logrando producir una reacción identificable mediante el IWB. Para lograr una correcta identificación de la CRT mediante espectrometría de masas, se requiere obtener una muestra más purificada y de esta manera evitar el reconocimiento de otras proteínas contaminantes. Por otro lado, la espectroscopía de Raman, con la longitud de onda utilizada (785 nm), no fue posible identificar un espectro específico que pudiese confirmar la presencia de CRT en el líquido sinovial equino de animales clínicamente sanos. Con la información obtenida en este estudio, es posible suponer que la CRT puede estar cumpliendo algún rol en la homeostasis articular, sin embargo, otros experimentos son necesarios para lograr su completa identificación. / The goal for this research was to investigate the presence of Calreticulin in the equine synovial fluid obtained from the radio carpal joint of Thoroughbred horses and thus describe a protein that has not been identified in this specie so far. Five clinically healthy horses were selected and a synovial fluid sample was obtained from each one. Synovial fluid samples obtained were analyzed by a polyacrylamide gel electrophoresis and western blotting using anti Trypanosoma cruzi Calreticulin (TcCRT) and anti Human Calreticulin (HuCRT) antibodies, allowing an antigenic recognition of the protein. TcCRT and HuCRT served as positive controls. Additionally, challenge between the equine synovial fluid and C1q of the human complement system was studied by western blot. Also, a combinatorial peptide ligand library technology assay was performed to deplete high concentration proteins, like albumin, which can mask and difficult the access to low concentration proteins. The aforementioned assay changed the synovial fluid electrophoretic pattern. Finally, the immunoreactive protein was studied by MALDI-TOF mass spectrometry and Raman spectroscopy. The western blot demonstrated a positive reaction that allowed detection of a band of 50 kDa when anti HuCRT antibody was used. The challenge to C1q did not generate a positive reaction evidencing a failed binding between EqCRT from synovial fluid with human C1q. The presence of CRT in the equine synovial fluid could not be confirmed by both mass spectrometry and Raman spectroscopy using the experimental design proposed for this study thus further investigation is required to fully identify the protein in the equine synovial fluid. The EqCRT was only recognized by anti HuCRT antibody, which was probably due to higher homology between the human and equine proteins. On the other hand, no reaction was evidenced when the EqCRT was challenged against C1q, nevertheless, that is attributable to an experimental design problem in which very low concentrations of protein were used so the western blot was not able to generate a detectable signal. Due to experimental design, it was not possible to fully confirm the presence of the protein in the equine synovial fluid from clinically healthy animals using Mass spectrometry and Raman spectroscopy. However, the information gathered in this study imply that CRT may be present in the synovial fluid of horses and it might be a protein involved in the homeostasis of joints but further investigation is required.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las Metaloproteinasas (MMPs) son una familia de endopeptidasas involucradas tanto en los procesos de remodelación tisular, como en la degradación de los componentes de la matriz extracelular. Las MMP-2 y MMP–9, conocidas también como gelatinasas, son capaces de degradar elementos de la matriz extracelular. Estas enzimas están asociadas a procesos degradativos como el que ocurre en la enfermedad degenerativa articular (EDA). Las MMPs son secretadas en forma zimógenas, expresadas como proMMPs. Este trabajo tiene como objetivo determinar la actividad gelatinolítica de MMP-2 y MMP-9 en el líquido sinovial (LS) de articulación del carpo y en suero sanguíneo (S) de equinos Fina Sangre de Carrera (FSC), con procesos articulares agudos y crónicos reagudizados. Se detecta y cuantifica la actividad mediante zimografía, y se comparan las actividades detectadas en ambos grupos de estudio. Se utilizó LS proveniente de la articulación del carpo y S de equinos FSC del Hipódromo Chile de dos grupos de animales. El primer grupo correspondió a equinos con inflamación aguda (grupo A, n = 10). El segundo grupo correspondió a aquellos con patología articular crónica re-agudizada (grupo C, n = 15). Además se obtuvieron 5 muestras de S desde ejemplares sin patología articular, a modo de referencia, y no para consideraciones estadísticas. Se midió la concentración de proteínas totales (PT) de cada muestra. Se determinó la actividad gelatinolítica de cada muestra mediante zimografía en gel de poliacrilamida al 8% con gelatina 0,1%. Estos geles fueron digitalizados y densitometrados, cuantificando el número de pixeles asociados a cada banda con actividad gelatinolítica. La actividad gelatinásica se expresó en unidades relativas a la muestra control cargada en cada gel (u.r.), y a las u.r. en relación a los mg de PT. Los resultados se presentaron como promedio de u.r.  desviación estándar, comparándose los distintos grupos mediante análisis de varianza (andeva). No se detectaron diferencias significativas entre el grupo A y C, tanto en LS como en S. Se detectó actividad de proMMP-2 en todas las muestras, y la actividad de la proMMP-9 fue detectada en todas las muestras de S pero sólo en un 80,8% de las muestras de LS. Respecto a la proMMP-2, no se detectó diferencia significativa en su actividad sérica entre los grupoa A y C, incluso al dividir por las PT. En los grupos A y C no se evidenció diferencia para la actividad proMMP-2 entre S y LS, pero al considerar las PT como denominador, se encontró que en el grupo A la actividad de la proMMP-2 es significativamente mayor en el LS que en el S. Tanto en el grupo A como en el C, la actividad de la proMMP-2 en el LS fue significativamente mayor que la de MMP-9. Dentro de las muestras en las que se detectó la proMMP-9, no se encontraron diferencias significativas entre la actividad de la proMMP-9 del LS entre los grupos A y C. La forma dímera de la MMP-9 en LS se detectó sólo en S, en 16 de sus muestras (61.5% del total de muestras de S estudiadas) En las muestras de S del grupo de ejemplares normales, ambas enzimas presentaron valores de actividad significativamente menores al compararlos con la de los grupos A y C. Las gelatinasas no cambian de manera importante su actividad gelatinolítica al comparar grupos con patologías articulares agudas, con ejemplares con patologías crónicas reagudizadas, tanto en el LS como en el S. Así también podemos concluir que las gelatinasas no se comportan igual en los distintos medios, teniendo mayor actividad la MMP-9 en S y la MMP-2 en LS. Al tener el S de ejemplares normales una menor actividad gelatinolítica, queda como posibilidad el uso de gelatinasas en S como marcadores de daño articular

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La fisiopatología/etiología de la enfermedad degenerativa articular ha demostrado que esta es una patología asociada a estrés oxidativo. No existen antecedentes concluyentes acerca de la capacidad antioxidante del líquido sinovial (LS). Es por ello, que en este trabajo se evaluó el efecto antioxidante de Acido Hialurónico (AH), Condroitín-Sulfato (CS) y LS proveniente de la articulación metacarpo falángica equina normal, con daño crónico y con membrana sinovial congestiva. Este efecto se evaluó en un sistema biológico constituido por una fracción enriquecida en retículo endoplásmico de hígado de rata (microsomas) sometida a estrés oxidativo por Fe+3/ascorbato, que es un sistema generador de especies radicalarias del oxígeno. Los LS de articulación normal y con daño crónico inhibieron significativamente la lipoperoxidación microsómica inducida por Fe+3/ascorbato (40%) (p<0,05), efecto que no fue dependiente de la concentración, aunque los volúmenes ensayados de LS fluctuaron entre 10 y 100 L. El LS de la articulación con membrana sinovial congestiva, produjo un efecto significativamente menor (16%), el que fue observado sólo con el volumen de 100 L. El AH y CS no inhibieron la lipoperoxidación microsómica. Por otro lado, todos LS ensayados presentaron actividad Glutatión transferasa (GSH-T) equivalente aproximadamente al 10% de la actividad total microsómica en los LS provenientes de articulación normal y con daño crónico y al 12%, en el LS de articulación con membrana sinovial congestiva. Más aún, la presencia en los LS, de AH y CS previno el daño oxidativo sobre la GSH-T microsómica inducido por Fe+3/ascorbato. Por otra parte, los LS de articulación normal y con daño crónico no afectaron la disminución de los tioles microsómicos inducida por Fe+3/ascorbato; sin embargo, el LS proveniente de la articulaciones con membrana sinovial congestiva, AH y CS la inhibieron significativamente (p<0,05). Estos resultados indicarían que en los LS existirían diferentes mecanismos antioxidantes, los que estarían asociados a cada condición articular. Así el LS de articulación con membrana sinovial congestiva protegió los grupos tioles y la actividad GSH-T, mientras que los LS de articulación normal y con daño crónico ejercen una mayor acción protectora frente a la lipoperoxidación / Proyecto FIV 2007 Nº 12100101 4602018

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / La osteoartritis es la enfermedad articular más común en la especie equina, que provoca dolor y disminución de la movilidad articular, cuya consecuencia es la disminución del desempeño deportivo. La osteoartritis se caracteriza por la destrucción del cartílago articular, que se manifiesta por úlceras focales y fragmentación. El óxido nítrico (NO) participaría como un importante mediador biológico en la patología articular, que podría alterar la homeostasis del cartílago conduciendo a su destrucción. El NO es un radical libre, gaseoso, sintetizado a partir del aminoácido L-arginina, por una familia de isoenzimas conocidas como óxido nítrico sintasas (NOS). Se ha descrito que el NO participaría en una amplia variedad de procesos biológicos, siendo oxidado en el medio biológico a nitrito y nitrato, los que se han utilizado como marcadores de su biosíntesis. En las articulaciones diartrodiales los condrocitos son la principal fuente de NO. Para desarrollar el presente trabajo, se obtuvo líquido sinovial de 110 articulaciones metacarpofalángicas de equinos mestizos de matadero, cuya selección se realizó de acuerdo al aspecto macroscópico (normal o alterado) del cartílago articular y de la membrana sinovial, generándose cuatro grupos de articulaciones: NN = cartílago y membrana normales (n = 47); NA = cartílago normal y membrana alterada (n= 25); AN = cartílago alterado y membrana normal (n = 23); AA = cartílago y membrana alterados (n = 15). Se determinaron las concentraciones de proteína y de nitrito por los métodos de Lowry y de Griess, respectivamente. Además, se determinó la edad de los animales por cronometría dentaria. Se aplicó análisis de varianza y una posterior prueba de Tukey para observar diferencias entre grupos articulares. El promedio de edad de los equinos fue de 5.3  3.6 años en el grupo NN, 4.4  3.1 años en el grupo NA, 9.9  4.2 años en el grupo AN y 10.7  3.8 años en el grupo AA. Los grupos NN y NA presentaron una edad significativamente menor (p = 0.001) que los grupos AN y AA. La concentación de proteína en el líquido sinovial fue de 15.2  6.3 mg/mL en las articulaciones NN, 13.4  8.4 mg/mL en las articulaciones NA, 14.4  7.4 mg/mL en las articulaciones AN y 10.8  5.4 mg/mL en las articulaciones AA. No se encontró diferencias significativas (p  0.05) de concentración de proteínas entre los grupos. La concentración de nitrito en el líquido sinovial fue de 29.4  27.9 M en las articulaciones NN, 44.4  32.6 M en las articulaciones NA, 32.6  27 M en las articulaciones AN y 26.3  26.1M en las articulaciones AA. No se encontró diferencias significativas (p  0.05) en la concentración de nitritos entre los grupos de articulaciones. Estos datos sugieren que las articulaciones normales (NN) especialmente en su cartílago son más frecuentes en equinos jóvenes, presentando una leve tendencia a tener un promedio de concentración de proteínas mayor y nitritos detectables en baja concentración, pero si la membrana sinovial se encuentra alterada (AN) se produce un aumento del promedio de los nitritos probablemente por la estimulación de la membrana sinovial al cartílago articular a través de citoquinas. Las articulaciones con mayor alteración (AA) fueron aquellas pertenecientes al grupo de mayor edad promedio y que presentó menor concentración promedio de proteínas y de nitritos, lo que se explicaría por la destrucción tanto de la membrana como del cartílago y por ende, menor cantidad y funcionalidad de los sinoviocitos y condrocitos