O L-glutamato (L-Glu) é o principal neurotransmissor excitatório em vertebrados e é fundamental para funções primordiais do sistema nervoso central (SNC), tais como aprendizagem e memória. Entretanto, quando este neurotransmissor está em excesso na fenda sináptica, pode provocar uma série de eventos excitotóxicos, que por sua vez, estão associados a muitas neuropatologias. A terapia da maioria dessas doenças é ineficiente e provoca sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver fármacos mais efetivos e com menos efeitos colaterais. Assim, peçonhas de artrópodes como a da aranha P. bistriata, se apresentam como fontes alternativas de compostos neuroativos, pois já demonstraram efeitos neuroprotetores in vitro e in vivo, bem como anticonvulsivos. Destarte, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor da fração RT10, isolada da peçonha de P.bistriata, em cultura primária de neurônios e glia (CPNGs), do tecido nervoso de ratos recém-nascidos, expostos a concentrações tóxicas de L-Glu (5 mM). As CPNGs foram tratadas durante 3 horas, previamente à lesão, que foi feita por um período de 12h. Ambas as exposições (tratamento e lesão) foram conduzidas no 7.º dia in vitro (DIV). Para analisar quantitativamente e qualitativamente os efeitos dos tratamentos, bem como demonstrar a composição das CPNGs foram realizados ensaios de viabilidade celular, com o sal sódico de resazurina (SSR) e, imunomarcações com anticorpos primários para MAP2, NeuN e GFAP. A fração RT10 foi neuroprotetora, pois diminuiu a perda celular nos testes com o SSR em 10%, nas CPNGs, expostas ao L-Glu, além de apresentarem efeito maior (5%), que o do fármaco Riluzol (RIL). A neuroproteção da RT10 também foi observada nos ensaios de imunocitoquimica. Os neurônios tratados com RT10 e RIL, que foram marcados com anti-MAP2 tiveram maior prolongamentos dos dendritos em relação aos neurônios não tratados. Portanto, a intensidade da fluorescência de anti-MAP2 para os neurônios tratados com esta fração foi 38% maior em relação aos não tratados; e 21% maior quando comparados ao grupo RIL. Deste modo, podemos considerar a RT10, como uma ferramenta para a prospecção de novos fármacos contra neurodegenerações, in vitro e principalmente estudos de mecanismo de ação, cujas variáveis podem ser mais bem controladas. / L-Glutamate (L-Glu), the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates, is essential to the occurrence of cognitive functions. However, when L-Glu is over-accumulated in a synaptic cleft it can provoke excitotoxicity (EXT), which has been implicated in many neurological disorders (NDs). The current therapies against NDs are undereffective and can provoke side effects, so it is necessary to develop new treatments. In this regard, neuroactive compounds obtained from Parawixia bistriata spider venom are an alternative source of neuroactive compounds, because they showed neuroprotective effects in vitro and in vivo. Thus, the main aim of this work was to evaluate a possible neuroprotective effect of RT10 fraction obtained from P. bistriata venom in primary culture of neuron and glial cells (PCNGCs) from cerebral tissue of newborn Wistar rats, after the exposition to L-glu toxic concentration (5mM). The PCNGCs were submitted to the neuroprotection treatments for 3 hours and previously to the neurotoxic treatment, which the L-glu stayed for 12h in the PNGCs. The both expositions were conducted on the 7th day in vitro (DIV). The Resazurin sodium salt (RSS) and immunocytochemistry (MAP2, NeuN e GFAP primary antibodies) trials were utilized to measure quantitatively and qualitatively the treatments, as well as to prove the culture composition. In the RSS trial, the RT10 was neuroprotector, since avoided the cell death in 10%, under the PCNGCs which were exposed to L-Glu. in addition, RT10 demonstrated higher effect than rilozole (5%). RT10 attenuated the toxic effects of L-Glu under the neuromorphology, consequently the fluorescence intensity of MAP2 at PCNGC treated with RT10 was 38% higher than untreated group and it was 21% higher than riluzole group. Thus, we can consider that RT10 compounds are valuable tools to the prospection of new drugs against NDs.

Submitted by Ana Damasceno (ana.damasceno@unipampa.edu.br) on 2016-09-13T20:01:43Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-13T20:01:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Investigação bioquímica e eletrofisiológica da atividade neurotóxica da urease de Canavalia Ensiformis sobre o sistema nervoso de mamíferos.pdf: 4036702 bytes, checksum: 7c0fc1ca67b3af15c724790f838de2ed (MD5) Previous issue date: 2016 / A urease de Canavalia ensiformis (Jack Bean Urease, JBU) possui uma cadeia polipeptídica de 90.770 kDa, com 840 resíduos de aminoácidos. Do ponto de vista biotecnológico, já foram caracterizadas suas ações fungicida e inseticida. Quando administrada na corrente sanguínea de mamíferos, esta, induz convulsões que culminam em morte dos animais, um efeito cujo mecanismo de ação ainda carece de investigação. O objetivo desse trabalho foi investigar os padrões eletrofisiológicos da JBU no sistema nervoso central e periférico de roedores in vivo e in vitro, e as correlações bioquímicas em termos de viabilidade celular e exocitose do L-glutamato. Nos ensaios bioquímicos, verificou-se aumento na liberação de L-glutamato em sinaptossomas corticais de ratos na concentração de 100 nM. Os ensaios de viabilidade celular por MTT em fatias de hipocampo de camundongos não demonstraram alterações. Nos ensaios eletrofisiológicos, verificou-se redução significativa na amplitude do potencial de ação composto (CAP) de nervo ciático de camundongo, nas doses de 1 e 10 nM. Nos ensaios eletroencefalográficos em ratos a injeção da urease (10nM) no hipocampo induziu um traçado de espícula-onda. A redução na amplitude do CAP provavelmente está relacionada a uma inibição dos canais de sódio voltagem-dependentes, já que a administração posterior de tetrodotoxina, não aumentou o nível de bloqueio da condução. Nossos resultados demonstram um efeito excitatório da JBU do tipo crise de ausência sobre o sistema nervoso central de mamíferos. Este resultado sugere o envolvimento dos canais de Ca2+ do tipo T nos efeitos excitatórios da JBU. O bloqueio da condução do nervo ciático de camundongos sugere o envolvimento de canais de Na+ voltagem dependentes, o qual corroboraria a atividade excitatória da urease sobre o sistema nervoso central de mamíferos. / The Canavalia ensiformis urease (Jack Bean Urease) has a 90,770 kDa, polypeptide containing 840 aminoacid residues. JBU is known to exhibit insecticidal and fungicidal activities. When administered endovenously in mammalians, it induces tonic clonic convulsions culminating in the death of the animals. This mechanisms involved in the excitatory activity of JBU has not been elucidated so far. In this work, we sought to investigate the central and peripheral electrophysiological patterns of Jack Bean Urease in rodents, in vivo and in vitro, as well as the biochemical correlation of cell viability and glutamate release. In the biochemical assays, JBU induced increase in L-Glutamate release in rat cortical sinaptossomes, with no alteration of mice hippocampal cell viability. The electrophysiological assays, showed that JBU induce a significant decrease on mice sciatic nerve compound action potentials (CAP), and spike-wave discharges (SWD) similar to “petit mal” seizures when injected directly in the hippocampus (10 nM). The decrease in CAP amplitude is related to a blockage of voltage-gated sodium channels, since it was not affected by the concomitant application of tetrodotoxin. Our results show that JBU exerts an effect of spike wave discharges-like activity over the mammalian central nervous system. This later result suggests an involvement of T-type voltage gated calcium channels in the excitatory activity of JBU. The blockade of mouse sciatic nerve compound action potential conduction corroborates the excitatory activity of the urease upon the mammalian central nervous system.

O L-glutamato (L-Glu) é o principal neurotransmissor excitatório em vertebrados e é fundamental para funções primordiais do sistema nervoso central (SNC), tais como aprendizagem e memória. Entretanto, quando este neurotransmissor está em excesso na fenda sináptica, pode provocar uma série de eventos excitotóxicos, que por sua vez, estão associados a muitas neuropatologias. A terapia da maioria dessas doenças é ineficiente e provoca sérios efeitos colaterais. Portanto, é necessário desenvolver fármacos mais efetivos e com menos efeitos colaterais. Assim, peçonhas de artrópodes como a da aranha P. bistriata, se apresentam como fontes alternativas de compostos neuroativos, pois já demonstraram efeitos neuroprotetores in vitro e in vivo, bem como anticonvulsivos. Destarte, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor da fração RT10, isolada da peçonha de P.bistriata, em cultura primária de neurônios e glia (CPNGs), do tecido nervoso de ratos recém-nascidos, expostos a concentrações tóxicas de L-Glu (5 mM). As CPNGs foram tratadas durante 3 horas, previamente à lesão, que foi feita por um período de 12h. Ambas as exposições (tratamento e lesão) foram conduzidas no 7.º dia in vitro (DIV). Para analisar quantitativamente e qualitativamente os efeitos dos tratamentos, bem como demonstrar a composição das CPNGs foram realizados ensaios de viabilidade celular, com o sal sódico de resazurina (SSR) e, imunomarcações com anticorpos primários para MAP2, NeuN e GFAP. A fração RT10 foi neuroprotetora, pois diminuiu a perda celular nos testes com o SSR em 10%, nas CPNGs, expostas ao L-Glu, além de apresentarem efeito maior (5%), que o do fármaco Riluzol (RIL). A neuroproteção da RT10 também foi observada nos ensaios de imunocitoquimica. Os neurônios tratados com RT10 e RIL, que foram marcados com anti-MAP2 tiveram maior prolongamentos dos dendritos em relação aos neurônios não tratados. Portanto, a intensidade da fluorescência de anti-MAP2 para os neurônios tratados com esta fração foi 38% maior em relação aos não tratados; e 21% maior quando comparados ao grupo RIL. Deste modo, podemos considerar a RT10, como uma ferramenta para a prospecção de novos fármacos contra neurodegenerações, in vitro e principalmente estudos de mecanismo de ação, cujas variáveis podem ser mais bem controladas. / L-Glutamate (L-Glu), the major excitatory neurotransmitter in the central nervous system of vertebrates, is essential to the occurrence of cognitive functions. However, when L-Glu is over-accumulated in a synaptic cleft it can provoke excitotoxicity (EXT), which has been implicated in many neurological disorders (NDs). The current therapies against NDs are undereffective and can provoke side effects, so it is necessary to develop new treatments. In this regard, neuroactive compounds obtained from Parawixia bistriata spider venom are an alternative source of neuroactive compounds, because they showed neuroprotective effects in vitro and in vivo. Thus, the main aim of this work was to evaluate a possible neuroprotective effect of RT10 fraction obtained from P. bistriata venom in primary culture of neuron and glial cells (PCNGCs) from cerebral tissue of newborn Wistar rats, after the exposition to L-glu toxic concentration (5mM). The PCNGCs were submitted to the neuroprotection treatments for 3 hours and previously to the neurotoxic treatment, which the L-glu stayed for 12h in the PNGCs. The both expositions were conducted on the 7th day in vitro (DIV). The Resazurin sodium salt (RSS) and immunocytochemistry (MAP2, NeuN e GFAP primary antibodies) trials were utilized to measure quantitatively and qualitatively the treatments, as well as to prove the culture composition. In the RSS trial, the RT10 was neuroprotector, since avoided the cell death in 10%, under the PCNGCs which were exposed to L-Glu. in addition, RT10 demonstrated higher effect than rilozole (5%). RT10 attenuated the toxic effects of L-Glu under the neuromorphology, consequently the fluorescence intensity of MAP2 at PCNGC treated with RT10 was 38% higher than untreated group and it was 21% higher than riluzole group. Thus, we can consider that RT10 compounds are valuable tools to the prospection of new drugs against NDs.

The primary purpose of this study was to investigate the combination of experimental and computational methods in the search for reproducible colloidal surface-enhanced Raman scattering of pharmaceutical compounds. In the search for optimal experimental conditions for colloidal surface-enhance Raman scattering, the amphipathic β-blocker propranolol was used as the target molecule. Fractional factorial designs of experiments were performed and a multiobjective evolutionary algorithm was used to find acceptable solutions, from the results, that were Pareto ranked. The multiobjective evolutionary algorithm suggested solutions outside of the fractional factorial design and the experiments were then performed in the laboratory. The results observed from the suggested solutions agreed with the solutions that were found on the Pareto front. One of the experimental conditions observed on the Pareto front was then used to determine the practical limit of detection of propranolol. The experimental conditions that were chosen for the limit of detection took into account reproducibility and enhancement, the two most important parameters for analytical detection using surface-enhanced Raman scattering. The principal conclusion to this study was that the combination of computational and experimental methods can reduce the need for experiments by > 96% and then selecting solutions from the Pareto front improved limit of detection by a factor of 24.5 when it was compared to the previously reported limit of detection for propranolol. Using the same experimental conditions that were used for the limit of detection, these experiments were extended to plasma spiked with propranolol in order to test detection of this pharmaceutical in biofluids. Concentrations of propranolol were prepared using plasma as the solvent and measured for detection using colloidal surface-enhanced Raman scattering. Detection was determined as <130 ng/mL, within physiological concentrations, previously achieved using separation techniques. The second part of this thesis also involved a combination of experimental and computational methods. Raman optical activity was utilized to investigate secondary structure of amino acids and diamino acid peptides in combination with density functional theory calculations. Amino acids are important biological molecules that have vital functions in the biological system. They have been recognized as neurotransmitters and implicated in neurodegenerative diseases. Raman and Raman optical activity experimental results were compared to determine site-specific acetylation, marker bands for constitutional isomers and identification of functional groups that interact with the solvent. The experimental spectra were then compared to those from the density functional theory calculations. The results indicated that; constitutional isomers cannot be distinguished from the Raman spectra but can be distinguished from the Raman optical activity spectra, site-specific acetylation can be identified from the Raman spectra, however, Raman optical activity provides more structural information in relation to acetylation. When the results were compared to the density functional theory calculations for the diamino acid peptides the results agreed reasonably well, however, agreement was not as good for the monoamino acids because diamino acid peptides support fewer conformations due to the peptide bond whereas monoamino acids can adopt a far greater number of conformations. Combined computational and experimental techniques have developed the ability to detect and characterize biomedical compounds, a significant move in the advancement of Raman spectroscopies.